目的:本實(shí)驗(yàn)中利用ELISA、MTT和Western Blotting等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的方法,探究乙醛刺激肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中TGF-β信號(hào)通路相關(guān)的機(jī)制,并通過(guò)刺激肝星狀細(xì)胞活化的方法來(lái)觀察TGF-β信號(hào)通路的功能及效應(yīng)。首先,乙醛刺激肝星狀細(xì)胞株并設(shè)置不同的刺激時(shí)間,可通過(guò)MTT法來(lái)檢測(cè)活化肝星狀細(xì)胞的增殖水平;通過(guò)ELISA法測(cè)定肝星狀細(xì)胞內(nèi)纖維粘連素FN以及膠原蛋白I含量,證明乙醛能有效得刺激肝星狀細(xì)胞株的活化,并比較不同刺激時(shí)間的差異。接著采用SB-431542特異性阻斷TGF-β信號(hào)通路結(jié)合乙醛刺激HSC細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)HSC內(nèi)ZEB1、α-SMA、Smad3和p-Smad3-S425的表達(dá),以探究TGF-β信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制。方法:①將細(xì)胞株分組為:（1）正常培養(yǎng)12小時(shí),（2）正常培養(yǎng)24小時(shí),（3）正常培養(yǎng)36小時(shí),（4）TGF-β阻斷正常培養(yǎng)24小時(shí),（5）TGF-β阻斷乙醛24小時(shí)刺激培養(yǎng),（6）乙醛12小時(shí)刺激培養(yǎng),（7）乙醛24小時(shí)刺激培養(yǎng),（8）乙醛36小時(shí)刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)相應(yīng)組的細(xì)胞到細(xì)胞融合度為70%至80%時(shí),用胎牛血清含量為0.4%的... 

【文章來(lái)源】：西南醫(yī)科大學(xué)四川省

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SB-431542處理大鼠肝星狀細(xì)胞12~36h后的生長(zhǎng)活性Fig1ThegrowthactivitiesofrathepaticstellatecellsweretreatedwithSB-431542for12~36h.

圖 2 SB-431542 處理后不同組別大鼠（Rat）肝星狀細(xì)胞 12~36h 后的 TIMP Ⅰ和 FN 表達(dá)改變；A 為 SB-431542 阻斷作用下 12~36h 后 TIMP Ⅰ表達(dá)的比較；B為 SB-431542 阻斷作用下 12~36h 后 FN 表達(dá)的比較Fig 2 TIMP Ⅰa nd FN expressive changs of rat hepatic stellate cells were treatedwith SB-431542 for 12~36h; A TIMP Ⅰ expression of hepatic stellate cells wretreated with SB-431542 for 12~36h; B FN expression of hepatic stellate cells wretreated with SB-431542 for 12~36h.

HSC 經(jīng)阻斷劑預(yù)處理后再分組刺激后提取細(xì)胞總蛋白，然g 為各組上樣量標(biāo)準(zhǔn)與預(yù)染蛋白 Marker 一起進(jìn)行 SDS-PAGE分離，為了避免樣品擴(kuò)散加樣速度要快，可在空白的孔中加樣品緩沖液已避免邊緣效應(yīng)。跑 5%濃縮膠電壓為 80V，跑膠電壓為 120V，電泳至溴酚藍(lán)前沿距凝膠底部 1cm 左右，為 2 至 3 小時(shí)左右。將分離膠取下后，用固定液（10%甲醇、、10%乙酸）固定 1 小時(shí)后，再用考馬斯亮藍(lán) R-250 染色液分鐘，之后與搖床上加入洗滌液（50%甲醇，50%蒸餾水）漂最后就得到了電泳圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖 3。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3519498