調(diào)控基因的表達(dá)和后續(xù)生成對人類病原體的持續(xù)和慢性感染至關(guān)重要,如乙型肝炎病毒（HBV）,感染全球范圍超過4億人,是導(dǎo)致肝臟疾病的重要原因。在這項(xiàng)研究中,我們首次提供了一個肝臟特異的微小RNA, miR-122,通過堿基配對相互作用方式與一個高度保守的HBV前基因組RNA序列結(jié)合,抑制HBV基因表達(dá)和復(fù)制的直接證據(jù)。miR-122的靶序列同時也位于病毒聚合酶mRNA的編碼區(qū)和核心蛋白mRNA的3,非編碼區(qū)。培養(yǎng)的細(xì)胞中,miR-122表達(dá)量的增加導(dǎo)致HBV基因表達(dá)和復(fù)制的減少,而在HBV復(fù)制和感染存在的情況下,miR-122的表達(dá)減少。此外,對臨床標(biāo)本的分析表明在HBV陽性患者外周血單核細(xì)胞中,miR-122水平和病毒載量之間在體內(nèi)呈負(fù)線性關(guān)系。我們的研究結(jié)果表明miR-122可通過和病毒靶序列的結(jié)合,下調(diào)HBV的復(fù)制,利于了解HBV持續(xù)/慢性感染,并且HBV導(dǎo)致的對miR-122表達(dá)的調(diào)控可能代表了促進(jìn)病毒發(fā)病機(jī)理的機(jī)制。一旦病毒的成分被模式識別受體識別,包括Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（RIG-I）樣解旋酶,細(xì)胞被激活,產(chǎn)生I型干擾素（IFN）和炎性細(xì)胞因子。這些途徑... 

【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 綜述
    第一章 乙型肝炎病毒
        1.1 HBV的歷史背景及其感染的流行病學(xué)簡介
        1.2 HBV的病毒特征
        1.3 HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制
            1.3.1 HBV的轉(zhuǎn)錄
            1.3.2 HBV的復(fù)制
        1.4 HBV的免疫發(fā)病機(jī)理
        1.5 人類宿主中的HBV周期
        1.6 HBV的預(yù)防和治療
            1.6.1 HBV的預(yù)防
            1.6.2 HBV的治療
    第二章 丙型肝炎病毒
        2.1 HCV的結(jié)構(gòu)和基因組
            2.1.1 HCV的結(jié)構(gòu)
            2.1.2 HCV的基因組結(jié)構(gòu)
        2.2 HCV的復(fù)制和生命周期
        2.3 HCV細(xì)胞內(nèi)逃避免疫機(jī)制
            2.3.1 宿主對感染的反應(yīng)
            2.3.2 HCV引起的宿主反應(yīng)
            2.3.3 HCV調(diào)控和逃避宿主反應(yīng)
            2.3.4 HCV調(diào)控干擾素通路
            2.3.5 HCV調(diào)控ISG的表達(dá)或功能
            2.3.6 病毒遺傳變異和感染后的宿主反應(yīng)
            2.3.7 miRNA及HCV感染
            2.3.8 HCV-宿主相互作用模型
    第三章 治療肝癌的新方法：小分子RNA(miRNA)療法
        3.1 miRNA和它們在病毒感染中的作用
        3.2 DNA病毒編碼的miRNA
            3.2.1 皰疹病毒編碼的miRNA
            3.2.2 埃博拉病毒編碼的miRNA(EBV)
        3.3 miRNAs編碼的其它DNA病毒
            3.3.1 猴腎病毒40(SV40)和其他多瘤病毒
            3.3.2 腺病毒編碼的miRNA
        3.4 RNA病毒編碼的miRNAs
        3.5 宿主miRNA及其同病毒感染的相互作用
            3.5.1 在病毒感染中起止面調(diào)節(jié)作用的miRNA
            3.5.2 在病毒感染中起負(fù)面調(diào)節(jié)作用的miRNA
        3.6 miRNA的肝臟生物學(xué)
            3.6.1 肝癌中的miRNA表達(dá)譜
            3.6.2 miRNA和病毒性肝炎
            3.6.3 肝特異性miRNA：miR-122在肝病中的特征
            3.6.4 肝癌中高表達(dá)miRNA：miR-21的特征
            3.6.5 miRNA可做為通用的抗癌治療因子
第二部分 肝特異性miRNA和HBV的相互作用研究
    第四章 前言
    第五章 在人肝細(xì)胞中HBV下調(diào)miR-122的表達(dá)
        5.1 引言
        5.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            5.2.1 細(xì)胞
            5.2.2 實(shí)時定量(Real-Time)PCR檢測引物
            5.2.3 工具酶
            5.2.4 其他生物試劑
            5.2.5 化學(xué)試劑和儀器
        5.3 實(shí)驗(yàn)方法
            5.3.1 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)
            5.3.2 細(xì)胞系總RNA提取及Real-Time PCR反應(yīng)
        5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            5.4.1 HepG2.2.15細(xì)胞中miR-122表達(dá)水平明顯低于HepG2細(xì)胞
            5.4.2 HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2細(xì)胞miRNA芯片分析結(jié)果
    第六章 miR-122抑制HBV基因的表達(dá)和復(fù)制
        6.1 引言
        6.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            6.2.1 細(xì)菌菌種和質(zhì)粒
            6.2.2 合成寡核苷酸
            6.2.3 哺乳動物細(xì)胞株/系
            6.2.4 細(xì)菌/細(xì)胞培養(yǎng)基
            6.2.5 化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器
            6.2.6 試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑
        6.3 實(shí)驗(yàn)方法
            6.3.1 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染用高純度質(zhì)量的提取(Tiangen試劑盒為例)
            6.3.2 哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇和凍存(見第五章)
            6.3.3 哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            6.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的檢測
            6.3.5 Northern Blot檢測HBV RNA水平
            6.3.6 HBV復(fù)制中間體(HBV capsid-associated viral DNA)熒光定量PCR檢測
        6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            6.4.1 通過轉(zhuǎn)染合成寡核苷酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)miR-122的表達(dá)水平
            6.4.2 miR-122抑制HBV蛋白的表達(dá)
            6.4.3 miR-122可抑制HBV RNA的表達(dá)及DNA的復(fù)制
    第七章 HBV聚合酶為miR-122的靶mRNA編碼基因
        7.1 引言
        7.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            7.2.1 細(xì)菌菌種和質(zhì)粒
            7.2.2 哺乳動物細(xì)胞株/系
            7.2.3 構(gòu)建所用引物：如表6.1所示
            7.2.4 工具酶、試劑盒及抗體
            7.2.5 其他生物試劑
            7.2.6 化學(xué)試劑和儀器
        7.3 實(shí)驗(yàn)方法
            7.3.1 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            7.3.2 哺乳動物的培養(yǎng)、復(fù)蘇和凍存(見第六章)
            7.3.3 哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            7.3.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測
            7.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)
        7.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            7.4.1 HBV聚合酶基因?yàn)閙iR-122的靶mRNA編碼基因
            7.4.2 miR-122也通過類似的機(jī)制調(diào)控adw亞型的HBV基因表達(dá)和復(fù)制
    第八章 miR-122通過與HBV的靶RNA序列堿基配對的相互作用調(diào)控HBV感染
        8.1 引言
        8.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            8.2.1 細(xì)菌菌種和質(zhì)粒
            8.2.2 哺乳動物細(xì)胞株/系
            8.2.3 構(gòu)建所需引物及合成寡合甘酸：如表8.1所示
            8.2.4 試劑及儀器
        8.3 實(shí)驗(yàn)方法
            8.3.1 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            8.3.2 哺乳動物的培養(yǎng)、復(fù)蘇和凍存(見第六章)
            8.3.3 哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            8.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的檢測(見第六章)
            8.3.5 HBV復(fù)制中間體(HBV capsid-associated viral DNA)熒光定量PCR檢測(見第六章)
            8.3.6 一步法突變構(gòu)建HBV1.3倍體上miR-122靶標(biāo)序列的相應(yīng)特異性位點(diǎn)突變體
            8.3.7 Northern Blot檢測HBV與miR-122的雜交
        8.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
    第九章 體內(nèi)HBV感染和miR-122表達(dá)水平的相關(guān)性研究
        9.1 引言
        9.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            9.2.1 臨床標(biāo)本
            9.2.2 試劑和儀器
        9.3 實(shí)驗(yàn)方法
            9.3.1 miRNA檢測(見第五章)
            9.3.2 血樣中外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離
            9.3.3 血樣中HBV病毒載量的熒光定量PCR檢測
        9.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
    第十章 總論
第三部分 在癌癥中普遍上調(diào)的miRNA和HCV的相互作用研究
    第十一章 前言
    第十二章 HCV的感染上調(diào)miR-21的表達(dá)
        12.1 引言
        12.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            12.2.1 細(xì)菌菌種,質(zhì)粒和病毒
            12.2.2 哺乳動物細(xì)胞株/系
            12.2.3 試劑及儀器
        12.3 實(shí)驗(yàn)方法
            12.3.1 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            12.3.2 哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇和凍存(見第六章)
            12.3.3 哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            12.3.4 miRNA檢測(見第五章)
            12.3.5 外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)
            12.3.6 HCV的感染和保存
            12.3.7 pFL-J6/JFH-1的線性化,體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)染
        12.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
    第十三章 miR-21可抑制HCV觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)物的表達(dá)
        13.1 引言
        13.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            13.2.1 合成寡核苷酸和實(shí)驗(yàn)所需引物
            13.2.2 病毒,試劑盒和抗體
            13.2.3 其它材料和儀器
        13.3 實(shí)驗(yàn)方法
            13.3.1 細(xì)胞上清中IFN-α蛋白含量的ELISA檢測
            13.3.2 半定量PCR檢測
            13.3.3 其它實(shí)驗(yàn)方法
        13.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            13.4.1 在肝細(xì)胞內(nèi)miR-21抑制HCV觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)物的合成
            13.4.2 miR-21通過拮抗HCV引起的IFN-α抗病毒反應(yīng)促進(jìn)HCV的復(fù)制
            13.4.3 miR-21的過表達(dá)可抑制IFN-α引起的抗病毒反應(yīng)
    第十四章 MyD88和IRAK1為miR-21的靶標(biāo)基因
        14.1 引言
        14.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
            14.2.1 合成寡核苷酸及實(shí)驗(yàn)所需引物
            14.2.2 哺乳動物細(xì)胞
            14.2.3 質(zhì)粒
            14.2.4 其它實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
        14.3 實(shí)驗(yàn)方法
            14.3.1 3’UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建
            14.3.2 流式細(xì)胞檢測
            14.3.3 其它實(shí)驗(yàn)方法
        14.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            14.4.1 miR-21調(diào)節(jié)TLR-7信號級聯(lián)通路中各組成成分的基因表達(dá)
            14.4.2 MyD88和IRAK1為miR-21的靶標(biāo)
            14.4.3 miR-21對IFN信號通路的調(diào)控受MyD88和IRAK1介導(dǎo)
    第十五章 總論
參考文獻(xiàn)
攻博期間發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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