肝臟是機(jī)體中最大的消化器官,也是體內(nèi)新陳代謝的重要場(chǎng)所,同時(shí)肝臟也是機(jī)體唯一具有再生能力的器官。在正常情況下,絕大部分的肝細(xì)胞處于細(xì)胞周期的靜息期,僅有0.001%⁰.01%的肝細(xì)胞在進(jìn)行有規(guī)律的DNA復(fù)制。而當(dāng)肝臟受到病理性損傷或者手術(shù)切除后,肝細(xì)胞便由原來(lái)的靜息期進(jìn)入G1期,從而進(jìn)行有絲分裂,細(xì)胞大量增殖,最終恢復(fù)到受損前的大小,從而完成肝臟的再生。肝臟再生機(jī)制的研究對(duì)于肝臟再生能力喪失或受損病人的救治以及肝臟功能的恢復(fù)都具有十分重要的意義。目前認(rèn)為肝臟再生過(guò)程中所必需的途徑大致可歸為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)等三個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò),三者相互作用,共同調(diào)控著肝臟再生這一復(fù)雜過(guò)程。當(dāng)前對(duì)于肝臟再生機(jī)理的認(rèn)識(shí)仍然是一個(gè)難題,當(dāng)中的眾多調(diào)控過(guò)程依然無(wú)法加以闡述。鑒于此,本次研究的目的在于篩選肝臟再生過(guò)程中新的功能基因,為肝臟再生的機(jī)理研究提供新的思路,為開(kāi)發(fā)新的具有肝臟保護(hù)作用的藥物,提供理論依據(jù)。本文的工作基礎(chǔ)是運(yùn)用基因芯片技術(shù),得到了小鼠CCl4損傷模型下,基因組轉(zhuǎn)錄的變化情況。通過(guò)這一結(jié)果,我們從在肝損傷恢復(fù)過(guò)程中上調(diào)的基因中選取了四個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物作為研究... 

【文章來(lái)源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 肝臟再生
    1.2 肝臟再生的分子機(jī)理
    1.3 肝臟再生模型
    1.4 趨化因子CCL2 及其受體CCR2
    1.5 鈣離子結(jié)合蛋白S100A11 和S100A6
    1.6 論文的主要研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 常用試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    2.3 常用溶液的配制
        2.3.1 常規(guī)溶液
        2.3.2 SDS 堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA 相關(guān)溶液
        2.3.3 蛋白電泳相關(guān)溶液
        2.3.4 Western blot 相關(guān)溶液
        2.3.5 ELISA 相關(guān)溶液
        2.3.6 HE 染色和免疫組織化學(xué)相關(guān)溶液
    2.4 方法
        2.4.1 肝臟組織總RNA 的提取
        2.4.2 肝臟組織總cDNA 的合成
        2.4.3 檢測(cè)RT-PCR 的cDNA 質(zhì)量
        2.4.4 基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.4.5 大量制備高純度的pcDNA3.1 以及插入外源基因的pcDNA3.1 重組質(zhì)粒
        2.4.6 高純度質(zhì)粒中內(nèi)毒素的清除以及內(nèi)毒素含量的測(cè)定
        2.4.7 小鼠肝損傷模型
        2.4.8 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染方法
        2.4.9 小鼠血液和肝臟樣品的采集
        2.4.10 組織包埋程序
        2.4.11 組織石蠟切片的制作
        2.4.12 常規(guī)HE 染色步驟
        2.4.13 PCNA 免疫組織化學(xué)
        2.4.14 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力的測(cè)定
        2.4.15 重組蛋白的小量原核表達(dá)
        2.4.16 重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.17 蛋白裂解處理方案
        2.4.18 Glutathione Sepharose 48 純化GST 融合蛋白及用Thrombin 酶解融合蛋白
        2.4.19 Glutathione Sepharose 48 樹(shù)脂的回收
        2.4.20 Bradford 法測(cè)蛋白溶液濃度
        2.4.21 多克隆抗體的制備
        2.4.22 抗體純化
        2.4.23 Western blot 檢測(cè)抗體效價(jià)
        2.4.24 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）
        2.4.25 His-Select~(TM) Nichel Affinity Gel 親和純化融合蛋白
        2.4.26 包涵體的變性和復(fù)性
第三章 結(jié)果
    3.1 CCL2 及其受體CCR2 在肝再生過(guò)程中的作用
        3.1.1 RT-PCR 獲得cDNA
        3.1.2 CCL2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
        3.1.3 pcDNA-CCL2 質(zhì)粒小鼠電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1.4 CCR2 氨基端55 個(gè)氨基殘基多肽的原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.5 CCR2_(Δ1-55) 的原核表達(dá)及純化
        3.1.6 CCR2_(Δ1-55) 多克隆抗體的制備
        3.1.7 CCR2_(Δ1-55) 抗體阻斷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1.8 CCL2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.9 CCL2 的原核表達(dá)及純化
    3.2 S100A11 在肝再生過(guò)程中的作用
        3.2.1 S100A11 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
        3.2.2 pcDNA-S100A11 質(zhì)粒小鼠電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.3 S100A11 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.4 S100A11 的原核表達(dá)及純化
    3.3 S100A6 在肝再生過(guò)程中的作用
        3.3.1 S100A6 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
        3.3.2 pcDNA-S100A6 質(zhì)粒小鼠電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.3 S100A6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
第四章 討論
第五章 結(jié)論和展望
    5.1 本文研究總結(jié)
    5.2 課題研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 克隆基因的開(kāi)放閱讀框序列
    附錄2 各種試劑盒使用步驟
    附錄3 pcDNA3.1，pGEX-4T-2 和pET-28 質(zhì)粒圖譜
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表或錄用的論文



本文編號(hào)：3445095