第一部分:生物信息學(xué)分析自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1調(diào)控的miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目的:分析自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1調(diào)控的miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方法:本文通過運用多種生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫,確定自噬基因,并探索其相關(guān)調(diào)控的miRNAs關(guān)系,理清這些miRNAs與其上游的轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因存在的反饋和前饋通路,以更好理解miRNAs在自噬發(fā)生過程中的作用機(jī)制,并為下一步實驗驗證其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制提供線索。結(jié)果:通過Pubmed數(shù)據(jù)庫篩選得LC3和Beclin1兩個自噬相關(guān)基因作為研究對象。利用miRWalk軟件分別預(yù)測得與LC3相互作用的miRNA共1191個,其中99個miRNA為4個預(yù)測軟件共同預(yù)測所得,從中的10個miRNA與自噬相關(guān);Beclin1與2132個miRNA存在結(jié)合位點,其中114個miRNA為4個預(yù)測軟件共同預(yù)測所得,從中17個miRNA參與自噬過程。經(jīng)文獻(xiàn)報道數(shù)量比對后,LC3選取miR-140-3p、miR-214-3p和mi R-301a-5p作為候選靶miRNA;Beclin1的靶miRNA為miR-124-3p、miR-21-3p和mi R-3... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

克隆psiCHECK-2-WT-Beclin1-3'UTR熒光活性的比較(P*<0.05comparedwithblankandNCgroups).(C):克隆psiCHECK-2-mut-Beclin1-3'UTR熒光活性的比較(P*>0.05與空

42Figure 4. miR-140-3p 靶向調(diào)控 LC3 (A): 一種含有 LC3 的 3’UTR 基因和突變的3'UTR 熒光素酶報告基因載體結(jié)構(gòu)示意圖. (B): 克隆 psiCHECK-2- WT-LC3-3' UTR熒光活性的比較 (P*< 0.05 compared with blank and NC groups). (C): 克隆psiCHECK-2- mut-LC3 -3' UTR 熒光活性的比較 (P*> 0.05 與空白對照級和陰性組比較)2.3 miR-124-3p 負(fù)向調(diào)控 Beclin1,miR-140-3p 負(fù)向調(diào)控 LC3 的表達(dá)為了進(jìn)一步探討 miR-124-3p 與 Beclin1，miR-141-3p 與 LC3 存在何種調(diào)控關(guān)系。首先，運用 RT-PCR 檢測了大鼠肝臟組織、正常肝細(xì)胞 BRL-3A 中 miR-140-3p.2 與miR-124-3p 相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示：miR-140-3p 與 miR-124-3p 在正常肝組織中的表達(dá)與鈍性撞擊傷后肝組織比較顯著增高，同時，在正常肝細(xì)胞 BRL-3A 中也呈高表達(dá)（Fig5a;Fig5 b)。.進(jìn)一步將一定濃度的 miR-140-3p 抑制劑，miR-124-3p 抑制劑分別轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞 BRL-3A 中 48 小時后，western-blotting 檢測到 LC3、Beclin1 蛋白相 對 表 達(dá) 水 平 顯 著 上 調(diào) （ Fig5c;Fig5 d). 一 定 濃 度 的 miR-140-3p mimics ，miR-124-3pmimis 分別轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞 BRL-3A 中 48 小時后，western-blotting 檢測


本文編號：3402775