目的本課題在CRISPR/Cas9技術(shù)的支持下,通過基因編輯Gp96序列,抑制其基因表達,研究Gp96在急性酒精性肝損傷過程中的作用及調(diào)控的分子機制。方法（一）設(shè)計質(zhì)粒:NCBI中檢索Gp96相關(guān)基因序列,在外顯子中查找人鼠相同的Gp96基因序列,根據(jù)二者的蛋白保守功能域位置,將靶向突變的目標(biāo)序列（CRISPR）設(shè)計在外顯子4⁹。將外顯子4至外顯子9進行序列比對,共發(fā)現(xiàn)6個相同的CRISPR序列位置,但經(jīng)脫靶率分析后最終設(shè)計出3個CRISPR序列,并構(gòu)建三種質(zhì)粒。（二）有效sgRNA篩選及驗證:將合成的三種質(zhì)粒1:1:1混合轉(zhuǎn)染小鼠成肌細胞C2C12,嘌呤酶素篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞,提取DNA進行PCR擴增、電泳、膠回收進行測序及有效sgRNA蛋白驗證。（三）體外實驗:培養(yǎng)小鼠成肌細胞C2C12,分為三組,Normal組:不做任何處理;Normal+alcohol組:直接給予酒精誘導(dǎo)培養(yǎng);Gp96-sgRNA+alcohol組:將有效sgRNA進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后給予酒精誘導(dǎo)培養(yǎng)。CCK-8細胞活性增殖檢測;Hoechst33258細胞凋亡染色;免疫印跡檢測相關(guān)因子表達:熱... 

【文章來源】：河南科技大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 酒精性肝損傷概述
        1.1.1 酒精性肝損傷的流行病學(xué)
        1.1.2 酒精性肝損傷的病理學(xué)特點
    1.2 酒精性肝損傷機制
        1.2.1 酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒作用
        1.2.2 氧化應(yīng)激與酒精性肝損傷
        1.2.3 細胞凋亡與酒精性肝損傷
    1.3 急性酒精性肝損傷模型的制備
    1.4 熱休克蛋白Gp96
        1.4.1 熱休克蛋白概述
        1.4.2 Gp96的分子結(jié)構(gòu)
        1.4.3 GP96的功能和應(yīng)用
    1.5 CRISPR/Cas9技術(shù)概述
        1.5.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制
        1.5.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用現(xiàn)狀
第2章 前言
第3章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 實驗動物
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 主要實驗試劑
        3.1.6 主要溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 實驗設(shè)計
        3.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Gp96基因三合一質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 細菌培養(yǎng)
        3.2.4 提取質(zhì)粒
        3.2.5 細胞培養(yǎng)
        3.2.6 確定最佳嘌呤酶素濃度
        3.2.7 細胞轉(zhuǎn)染
        3.2.8 嘌呤酶素篩選
        3.2.9 PCR技術(shù)檢測
        3.2.10 膠回收DNA
    3.3 體外實驗
        3.3.1 免疫印跡蛋白檢測
        3.3.2 CCK-8細胞活性檢測
        3.3.3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況
    3.4 體內(nèi)實驗
        3.4.1 血清AST、ALT酶活性的檢測
        3.4.2 肝組織蠟塊包埋及組織切片制作
        3.4.3 HE染色檢測各組小鼠的肝臟損傷情況
        3.4.4 PAS法檢測各組小鼠肝臟中糖原的表達情況
        3.4.5 Hoechst33258染色法檢測小鼠的肝細胞凋亡情況
        3.4.6 免疫印跡蛋白檢測
    3.5 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
第4章 結(jié)果
    4.1 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠GP96基因三合一質(zhì)粒
        4.1.1 設(shè)計CRISPR序列
        4.1.2 YSY線性化三合一CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        4.1.3 轉(zhuǎn)化子PCR驗證
        4.1.4 轉(zhuǎn)化子的測序驗證
    4.2 細胞轉(zhuǎn)染和sgRNA活性驗證
        4.2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測
        4.2.2 測序篩選sgRNA3為有效向?qū)NA
        4.2.3 免疫印記驗證有效sgRNA3
    4.3 細胞活性檢測結(jié)果
    4.4 細胞Hoechst33258染色結(jié)果
    4.5 免疫印跡法檢測細胞蛋白表達結(jié)果
    4.6 小鼠血清ALT、AST酶活性的檢測結(jié)果
    4.7 肝臟組織HE染色結(jié)果
    4.8 肝臟組織PAS染色結(jié)果
    4.9 肝臟組織Hoechst33258染色結(jié)果
    4.10 免疫印跡法檢測組織蛋白的表達結(jié)果
第5章 討論
    5.1 Gp96與酒精誘導(dǎo)的細胞毒性作用
    5.2 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96與轉(zhuǎn)氨酶和組織損傷的關(guān)系
    5.3 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和糖原儲備的關(guān)系
    5.4 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和細胞凋亡的關(guān)系
    5.5 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對肝細胞應(yīng)激分子HSP27、HSP70的影響
    5.6 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對肝細胞增殖的作用
    5.7 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和VEGF的關(guān)系
    5.8 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和p-STAT3信號途徑的關(guān)系
    5.9 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和CYP2E1的關(guān)系
    5.10 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和TNF-α的關(guān)系
    5.11 問題與展望
第6章 結(jié)論
參考文獻
縮略語詞匯表
附錄Ⅰ 圖及說明
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3394609