目的本課題在CRISPR/Cas9技術的支持下,通過基因編輯Gp96序列,抑制其基因表達,研究Gp96在急性酒精性肝損傷過程中的作用及調控的分子機制。方法（一）設計質粒:NCBI中檢索Gp96相關基因序列,在外顯子中查找人鼠相同的Gp96基因序列,根據二者的蛋白保守功能域位置,將靶向突變的目標序列（CRISPR）設計在外顯子4⁹。將外顯子4至外顯子9進行序列比對,共發(fā)現6個相同的CRISPR序列位置,但經脫靶率分析后最終設計出3個CRISPR序列,并構建三種質粒。（二）有效sgRNA篩選及驗證:將合成的三種質粒1:1:1混合轉染小鼠成肌細胞C2C12,嘌呤酶素篩選轉染成功的細胞,提取DNA進行PCR擴增、電泳、膠回收進行測序及有效sgRNA蛋白驗證。（三）體外實驗:培養(yǎng)小鼠成肌細胞C2C12,分為三組,Normal組:不做任何處理;Normal+alcohol組:直接給予酒精誘導培養(yǎng);Gp96-sgRNA+alcohol組:將有效sgRNA進行穩(wěn)定轉染后給予酒精誘導培養(yǎng)。CCK-8細胞活性增殖檢測;Hoechst33258細胞凋亡染色;免疫印跡檢測相關因子表達:熱... 

【文章來源】：河南科技大學河南省

【文章頁數】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 酒精性肝損傷概述
        1.1.1 酒精性肝損傷的流行病學
        1.1.2 酒精性肝損傷的病理學特點
    1.2 酒精性肝損傷機制
        1.2.1 酒精及其代謝產物對肝臟的毒作用
        1.2.2 氧化應激與酒精性肝損傷
        1.2.3 細胞凋亡與酒精性肝損傷
    1.3 急性酒精性肝損傷模型的制備
    1.4 熱休克蛋白Gp96
        1.4.1 熱休克蛋白概述
        1.4.2 Gp96的分子結構
        1.4.3 GP96的功能和應用
    1.5 CRISPR/Cas9技術概述
        1.5.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現
        1.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結構
        1.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制
        1.5.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用現狀
第2章 前言
第3章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞
        3.1.2 質粒
        3.1.3 實驗動物
        3.1.4 主要儀器設備
        3.1.5 主要實驗試劑
        3.1.6 主要溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 實驗設計
        3.2.2 CRISPR/Cas9技術靶向突變小鼠Gp96基因三合一質粒構建
        3.2.3 細菌培養(yǎng)
        3.2.4 提取質粒
        3.2.5 細胞培養(yǎng)
        3.2.6 確定最佳嘌呤酶素濃度
        3.2.7 細胞轉染
        3.2.8 嘌呤酶素篩選
        3.2.9 PCR技術檢測
        3.2.10 膠回收DNA
    3.3 體外實驗
        3.3.1 免疫印跡蛋白檢測
        3.3.2 CCK-8細胞活性檢測
        3.3.3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況
    3.4 體內實驗
        3.4.1 血清AST、ALT酶活性的檢測
        3.4.2 肝組織蠟塊包埋及組織切片制作
        3.4.3 HE染色檢測各組小鼠的肝臟損傷情況
        3.4.4 PAS法檢測各組小鼠肝臟中糖原的表達情況
        3.4.5 Hoechst33258染色法檢測小鼠的肝細胞凋亡情況
        3.4.6 免疫印跡蛋白檢測
    3.5 實驗數據的統(tǒng)計學分析
第4章 結果
    4.1 CRISPR/Cas9技術靶向突變小鼠GP96基因三合一質粒
        4.1.1 設計CRISPR序列
        4.1.2 YSY線性化三合一CRISPR/Cas9質粒構建
        4.1.3 轉化子PCR驗證
        4.1.4 轉化子的測序驗證
    4.2 細胞轉染和sgRNA活性驗證
        4.2.1 轉染效率檢測
        4.2.2 測序篩選sgRNA3為有效向導RNA
        4.2.3 免疫印記驗證有效sgRNA3
    4.3 細胞活性檢測結果
    4.4 細胞Hoechst33258染色結果
    4.5 免疫印跡法檢測細胞蛋白表達結果
    4.6 小鼠血清ALT、AST酶活性的檢測結果
    4.7 肝臟組織HE染色結果
    4.8 肝臟組織PAS染色結果
    4.9 肝臟組織Hoechst33258染色結果
    4.10 免疫印跡法檢測組織蛋白的表達結果
第5章 討論
    5.1 Gp96與酒精誘導的細胞毒性作用
    5.2 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96與轉氨酶和組織損傷的關系
    5.3 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和糖原儲備的關系
    5.4 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和細胞凋亡的關系
    5.5 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對肝細胞應激分子HSP27、HSP70的影響
    5.6 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對肝細胞增殖的作用
    5.7 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和VEGF的關系
    5.8 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和p-STAT3信號途徑的關系
    5.9 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和CYP2E1的關系
    5.10 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和TNF-α的關系
    5.11 問題與展望
第6章 結論
參考文獻
縮略語詞匯表
附錄Ⅰ 圖及說明
致謝
攻讀學位期間的研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CD133表位聯(lián)合熱休克蛋白佐劑疫苗引發(fā)抗白血病的免疫應答（英文）[J]. 王碩,范紅霞,李楊,鄭華國,李鑫,李長菲,陳立釗,鞠瑩,孟頌東.  生物工程學報. 2017(06)
[2]CYP2E1調控酒精性肝病發(fā)病機制的研究進展[J]. 陳丹,林秀賢,陳堯.  中國臨床藥理學與治療學. 2017(02)
[3]檉柳對小鼠酒精性肝損傷的保護作用及機制[J]. 張鈺,韓琛,王朝霞,王兆朋,張月英,周淑萍,馬冉冉,王恒孝.  山東大學學報(醫(yī)學版). 2017(02)
[4]CRISPR-Cas9研究及應用進展[J]. 李肅,吳楠,孫冬琳,金焰.  國際遺傳學雜志. 2016 (06)
[5]熱休克蛋白gp96 3′UTR作為ceRNA通過miR-642a調控DOHH的表達[J]. 盛春海,孫璐,初驍宇,李長菲,孟頌東.  生物化學與生物物理進展. 2016(10)
[6]腸道菌群與酒精性肝病[J]. 熊燕鵑,羅和生.  胃腸病學和肝病學雜志. 2016(09)
[7]對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷過程中IL-6跨信號途徑對PCNA表達的影響[J]. 韓紅梅,李三強,盧華杰,張勇勇,王秀秀,馬曌.  胃腸病學和肝病學雜志. 2016(09)
[8]小鼠酒精性肝損傷過程中肝糖原的表達變化[J]. 尚付梅,李三強,盧華杰,姜雅坤,喬新杰,白淼水,霍續(xù)磊,李小蘋,李思源,李英嬌.  中國臨床藥理學雜志. 2016(09)
[9]酒精性肝損傷的基礎醫(yī)學研究進展[J]. 王東,張宏峰,王改琴,賈書花.  長治醫(yī)學院學報. 2016(02)
[10]酒精性肝病流行病學及發(fā)病機制研究進展[J]. 高瀟雪,劉立新.  中華消化病與影像雜志(電子版). 2016(02)



本文編號：3394609