肝移植（liver transplantation，LT）是目前治療終末期肝�。╡nd stage liver disease，ESLD）的有效手段。在我國，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）相關肝病已成為肝移植的主要適應癥。但是肝移植術后，即使在使用拉米夫定（Lamivudine，LAM）和乙肝免疫球蛋白的情況下，仍有較高的HBV再感染率和乙肝（hepatitis B，HB）復發(fā)率，嚴重影響了肝移植的中遠期效果。本課題從研究乙肝病毒相關肝病肝移植術后的免疫-造血系統(tǒng)乙肝病毒庫入手，揭示肝移植術后HBV再感染/HB復發(fā)的可能機制。在第一部分，我們建立了一種靈敏可靠的檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法，為后繼的研究打下了基礎。在第二部分，我們利用密度梯度離心和免疫磁珠分離法獲得骨髓造血干祖細胞和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、T細胞、B細胞和單核細胞（monocyte，MNC），分別檢測總HBV DN... 

【文章來源】：四川大學四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：133 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
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英文摘要
前言
第一部分:酶輔助實時熒光定量PCR檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA方法的建立
    一.材料與方法
        1.試劑與材料、儀器
            1.1 試劑及配制
            1.2 材料
        2.實驗步驟
            2.1 HBVcccDNA標準品的制備
                2.1.1 pBHB4質粒的擴增
                2.1.2 pBHB4質粒DNA的提取與純化
            2.2 HBVrcDNA標準品的制備
            2.3 HBVcccDNA引物的設計、合成與選擇
                2.3.1 引物設計與合成
                2.3.2 引物的驗證
                    2.3.2.1 引物特異性驗證
                    2.3.2.2 引物靈敏度驗證
                    2.3.2.3 引物的選擇
            2.4 HBVcccDNA實時熒光定量PCR檢測方法(標準曲線)的建立
    二.實驗結果
    三.討論
    四.結論
第二部分:HBV相關終末期肝病肝移植受體術后外周免疫細胞與骨髓CD34+細胞總HBVDNA及HBVcccDNA檢測與臨床意義分析
    一.材料與方法
        1.病例選擇
        2.試劑與材料、儀器
            2.1 試劑
            2.2 材料
            2.3 儀器
        3.實驗步驟
            3.1 外周血及骨髓標本的采集
            3.2 外周血免疫活性細胞的分離
            3.3 骨髓造血干、祖細胞的分離
            3.4 DNA提取
            3.5 細胞內總HBVDNA檢測
            3.6 細胞內HBVcccDNA檢測
        4.統(tǒng)計方法
    二.實驗結果
        1.常規(guī)檢測結果
        2.每20ml樣品所獲細胞數
        3.血清HBV標志物及HBVDNA檢測結果
        4.細胞內總HBVDNA檢測結果
    三.討論
        3.1 肝移植術后受體外周免疫細胞及骨髓CD_(34)~+細胞內HBVDNA存在的意義
        3.2 肝移植術后受體外周免疫細胞及骨髓CD_(34)~+細胞內HBV復制狀態(tài)及其意義
    四.結論
第三部分:利用HBV-Alu-PCR檢測HBV相關肝病肝移植受體術后外周血單個核細胞與骨髓造血干祖細胞(CD_(34)~+)HBVX基因整合狀態(tài)
    一.材料與方法
        1.病例選擇
        2.試劑與材料、儀器
            2.1 試劑
            2.2 材料
            2.3 儀器
        3.實驗步驟
            3.1 外周血及骨髓標本采集
            3.2 PBMC與骨髓CD_(34)~+細胞分離獲取
            3.3 PBMC與骨髓CD_(34)~+細胞DNA提取
            3.4 HepG2.2.15肝癌細胞株DNA提取
            3.5 HBV-Alu-PCR原理
            3.6 HBV-Alu-PCR檢測HBVX基因整合
                3.6.1 引物設計與合成
                3.6.2 HBV-Alu-PCR反應步驟及條件
                3.6.3 結果判定及測序
                    3.6.3.1 終產物電泳
                    3.6.3.2 測序
    二.結果
    三.討論
    四.結論
全文參考資料
綜述:機體免疫系統(tǒng)功能與乙肝病毒負荷的關系
    一.HBV感染對免疫系統(tǒng)的影響
        1.HBV感染免疫細胞的機制與存在形式
        2.HBV感染對免疫細胞功能的影響
            2.1 對T細胞的影響
            2.2 HBV對B細胞的影響
            2.3 HBV對抗原提呈細胞的影響
            2.4 HBV對其他免疫活性細胞的影響
            2.5 HBV對細胞因子及其他免疫相關因子的影響
    二.機體免疫系統(tǒng)清除HBV的機制
        1.溶細胞的HBV清除機制
            1.1 抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)
            1.2 CTL作用
        2.非溶細胞的HBV清除機制
    三.HBV免疫逃逸機制
        1.HBV因素
            1.1 HBV基因整合
            1.2 HBV復制與轉錄水平的減弱
            1.3 HBV基因變異
            1.4 HBV的肝外分布
            1.5 HBV所致免疫耗竭
        2.機體因素
            2.1 免疫耐受
            2.2 遺傳因素
    四.HBV對治療的反應
        1.干擾素
        2.核苷類似物
        3.HBV疫苗
        4.肝移植術后體內HBV變化
    綜述參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Mechanism of T cell hyporesponsiveness to HBcAg is associated with regulatory T cells in chronic hepatitis B[J]. Yasuteru Kondo,Koju Kobayashi,Yoshiyuki Ueno,Masaaki Shiina,Hirofumi Niitsuma,Noriatsu Kanno,Tomoo Kobayashi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastroenterology. 2006(27)
[2]多重PCR法檢測外周血單個核細胞中的HBVDNA與HBVcccDNA[J]. 郭皓宇,譚德明,劉洪波.  中國醫(yī)師雜志. 2005(04)
[3]PBMC中HBV cccDNA與HBV宮內感染關系的研究[J]. 馮永亮,王素萍,史曉紅,王效軍,李鐵鋼.  現(xiàn)代預防醫(yī)學. 2005(03)
[4]肝癌中乙型肝炎病毒整合位點的分離鑒定[J]. 高海峰,屠紅.  中華肝臟病雜志. 2004(09)



本文編號：3390115