肝移植（liver transplantation，LT）是目前治療終末期肝�。╡nd stage liver disease，ESLD）的有效手段。在我國，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)肝病已成為肝移植的主要適應(yīng)癥。但是肝移植術(shù)后，即使在使用拉米夫定（Lamivudine，LAM）和乙肝免疫球蛋白的情況下，仍有較高的HBV再感染率和乙肝（hepatitis B，HB）復(fù)發(fā)率，嚴(yán)重影響了肝移植的中遠(yuǎn)期效果。本課題從研究乙肝病毒相關(guān)肝病肝移植術(shù)后的免疫-造血系統(tǒng)乙肝病毒庫入手，揭示肝移植術(shù)后HBV再感染/HB復(fù)發(fā)的可能機制。在第一部分，我們建立了一種靈敏可靠的檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，為后繼的研究打下了基礎(chǔ)。在第二部分，我們利用密度梯度離心和免疫磁珠分離法獲得骨髓造血干祖細(xì)胞和外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte，MNC），分別檢測總HBV DN... 

【文章來源】：四川大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：133 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分:酶輔助實時熒光定量PCR檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA方法的建立
    一.材料與方法
        1.試劑與材料、儀器
            1.1 試劑及配制
            1.2 材料
        2.實驗步驟
            2.1 HBVcccDNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
                2.1.1 pBHB4質(zhì)粒的擴增
                2.1.2 pBHB4質(zhì)粒DNA的提取與純化
            2.2 HBVrcDNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
            2.3 HBVcccDNA引物的設(shè)計、合成與選擇
                2.3.1 引物設(shè)計與合成
                2.3.2 引物的驗證
                    2.3.2.1 引物特異性驗證
                    2.3.2.2 引物靈敏度驗證
                    2.3.2.3 引物的選擇
            2.4 HBVcccDNA實時熒光定量PCR檢測方法(標(biāo)準(zhǔn)曲線)的建立
    二.實驗結(jié)果
    三.討論
    四.結(jié)論
第二部分:HBV相關(guān)終末期肝病肝移植受體術(shù)后外周免疫細(xì)胞與骨髓CD34+細(xì)胞總HBVDNA及HBVcccDNA檢測與臨床意義分析
    一.材料與方法
        1.病例選擇
        2.試劑與材料、儀器
            2.1 試劑
            2.2 材料
            2.3 儀器
        3.實驗步驟
            3.1 外周血及骨髓標(biāo)本的采集
            3.2 外周血免疫活性細(xì)胞的分離
            3.3 骨髓造血干、祖細(xì)胞的分離
            3.4 DNA提取
            3.5 細(xì)胞內(nèi)總HBVDNA檢測
            3.6 細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA檢測
        4.統(tǒng)計方法
    二.實驗結(jié)果
        1.常規(guī)檢測結(jié)果
        2.每20ml樣品所獲細(xì)胞數(shù)
        3.血清HBV標(biāo)志物及HBVDNA檢測結(jié)果
        4.細(xì)胞內(nèi)總HBVDNA檢測結(jié)果
    三.討論
        3.1 肝移植術(shù)后受體外周免疫細(xì)胞及骨髓CD_(34)~+細(xì)胞內(nèi)HBVDNA存在的意義
        3.2 肝移植術(shù)后受體外周免疫細(xì)胞及骨髓CD_(34)~+細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制狀態(tài)及其意義
    四.結(jié)論
第三部分:利用HBV-Alu-PCR檢測HBV相關(guān)肝病肝移植受體術(shù)后外周血單個核細(xì)胞與骨髓造血干祖細(xì)胞(CD_(34)~+)HBVX基因整合狀態(tài)
    一.材料與方法
        1.病例選擇
        2.試劑與材料、儀器
            2.1 試劑
            2.2 材料
            2.3 儀器
        3.實驗步驟
            3.1 外周血及骨髓標(biāo)本采集
            3.2 PBMC與骨髓CD_(34)~+細(xì)胞分離獲取
            3.3 PBMC與骨髓CD_(34)~+細(xì)胞DNA提取
            3.4 HepG2.2.15肝癌細(xì)胞株DNA提取
            3.5 HBV-Alu-PCR原理
            3.6 HBV-Alu-PCR檢測HBVX基因整合
                3.6.1 引物設(shè)計與合成
                3.6.2 HBV-Alu-PCR反應(yīng)步驟及條件
                3.6.3 結(jié)果判定及測序
                    3.6.3.1 終產(chǎn)物電泳
                    3.6.3.2 測序
    二.結(jié)果
    三.討論
    四.結(jié)論
全文參考資料
綜述:機體免疫系統(tǒng)功能與乙肝病毒負(fù)荷的關(guān)系
    一.HBV感染對免疫系統(tǒng)的影響
        1.HBV感染免疫細(xì)胞的機制與存在形式
        2.HBV感染對免疫細(xì)胞功能的影響
            2.1 對T細(xì)胞的影響
            2.2 HBV對B細(xì)胞的影響
            2.3 HBV對抗原提呈細(xì)胞的影響
            2.4 HBV對其他免疫活性細(xì)胞的影響
            2.5 HBV對細(xì)胞因子及其他免疫相關(guān)因子的影響
    二.機體免疫系統(tǒng)清除HBV的機制
        1.溶細(xì)胞的HBV清除機制
            1.1 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)
            1.2 CTL作用
        2.非溶細(xì)胞的HBV清除機制
    三.HBV免疫逃逸機制
        1.HBV因素
            1.1 HBV基因整合
            1.2 HBV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄水平的減弱
            1.3 HBV基因變異
            1.4 HBV的肝外分布
            1.5 HBV所致免疫耗竭
        2.機體因素
            2.1 免疫耐受
            2.2 遺傳因素
    四.HBV對治療的反應(yīng)
        1.干擾素
        2.核苷類似物
        3.HBV疫苗
        4.肝移植術(shù)后體內(nèi)HBV變化
    綜述參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Mechanism of T cell hyporesponsiveness to HBcAg is associated with regulatory T cells in chronic hepatitis B[J]. Yasuteru Kondo,Koju Kobayashi,Yoshiyuki Ueno,Masaaki Shiina,Hirofumi Niitsuma,Noriatsu Kanno,Tomoo Kobayashi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastroenterology. 2006(27)
[2]多重PCR法檢測外周血單個核細(xì)胞中的HBVDNA與HBVcccDNA[J]. 郭皓宇,譚德明,劉洪波.  中國醫(yī)師雜志. 2005(04)
[3]PBMC中HBV cccDNA與HBV宮內(nèi)感染關(guān)系的研究[J]. 馮永亮,王素萍,史曉紅,王效軍,李鐵鋼.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2005(03)
[4]肝癌中乙型肝炎病毒整合位點的分離鑒定[J]. 高海峰,屠紅.  中華肝臟病雜志. 2004(09)



本文編號：3390115