目的本課題使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制小鼠ADAM9基因的表達(dá),研究小鼠急性酒精性肝損傷過程中ADAM9基因的功能及其調(diào)控的分子機(jī)制。方法（1）在NCBI中搜索ADAM9相關(guān)的基因序列,并找出人鼠共有的ADAM9基因序列的外顯子和內(nèi)含子,在外顯子中查找人鼠相同CRISPR序列設(shè)計(jì)位點(diǎn)處的基因序列,構(gòu)建三個(gè)同時(shí)表達(dá)sgRNA、Puromycin和Cas9的三合一質(zhì)粒。（2）將3個(gè)質(zhì)粒以1:1:1的比例,加入小鼠成肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中,并加入細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染;繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,待細(xì)胞濃度達(dá)到70%左右時(shí),更換含有嘌呤霉素抗性的篩選培養(yǎng)基篩選耐藥陽(yáng)性細(xì)胞;待形成穩(wěn)定的陽(yáng)性克隆后,提取細(xì)胞DNA,進(jìn)行測(cè)序比對(duì),找出使細(xì)胞DNA產(chǎn)生突變的質(zhì)粒。（3）購(gòu)買健康清潔級(jí)昆明雄性小鼠36只,用普通飼料喂養(yǎng)一周待小鼠適應(yīng)環(huán)境后,隨機(jī)平均分為3組:正常組（Normal）12只,注射生理鹽水酒精灌胃組（saline+alcohol）12只,注射質(zhì)粒酒精灌胃組（ADAM9-sgRNA3+alcohol）12只。對(duì)照組小鼠不做任何處理,sgRNA組小鼠分別注入篩選出的活性質(zhì)粒,模型組小鼠尾靜脈注射等... 

【文章來源】：河南科技大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 酒精性肝損傷
        1.1.1 病理特點(diǎn)
        1.1.2 酒精性肝損傷動(dòng)物模型
    1.2 酒精性肝損傷過程中分子調(diào)控機(jī)制研究
        1.2.1 CYP2E1與酒精性肝損傷
        1.2.2 應(yīng)激分子與酒精性肝損傷
        1.2.3 TGF-βl與酒精性肝損傷
        1.2.4 肝細(xì)胞凋亡與酒精性肝損傷
    1.3 ADAM9介紹
    1.4 CRISPRCas9系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)與分類
        1.4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理
        1.4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)清除外源性DNA原理
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建
        1.4.4 降低CRISPR/Cas技術(shù)基因編輯脫靶效率的研究
第2章 前言
第3章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        3.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Adam9基因三合一質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)
        3.2.4 質(zhì)粒提取
        3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.7 最佳嘌呤酶素濃度
        3.2.8 嘌呤酶素篩選
        3.2.9 PCR技術(shù)檢測(cè)
        3.2.10 小鼠尾靜脈注射
        3.2.11 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        3.2.12 血清AST、ALT酶活性的檢測(cè)
        3.2.13 蠟塊包埋組織切片制作
        3.2.14 HE染色檢測(cè)各組小鼠的肝臟損傷情況
        3.2.15 PAS法檢測(cè)各組小鼠肝臟中糖原的表達(dá)情況
        3.2.16 Hoechst33258染色法檢測(cè)各組小鼠的肝細(xì)胞凋亡情況
        3.2.17 免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況
    3.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第4章 結(jié)果
    4.1 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Adam9基因三合一質(zhì)粒
    4.2 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)和sgRNA活性驗(yàn)證
    4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的檢測(cè)結(jié)果
    4.4 肝臟組織HE染色結(jié)果
    4.5 肝臟組織PAS染色結(jié)果
    4.6 肝臟組織Hoechst33258染色結(jié)果
    4.7 免疫印跡法檢測(cè)組織蛋白的表達(dá)結(jié)果
第5章 討論
    5.1 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9與轉(zhuǎn)氨酶和組織損傷的關(guān)系
    5.2 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和糖原儲(chǔ)備的關(guān)系
    5.3 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和細(xì)胞凋亡的關(guān)系
    5.4 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9對(duì)肝細(xì)胞應(yīng)激分子HSP27、HSP70的影響
    5.5 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9對(duì)肝細(xì)胞增殖的作用
    5.6 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和VEGF的關(guān)系
    5.7 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和IL-6信號(hào)途徑的關(guān)系
    5.8 問題與展望
第6章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語(yǔ)詞匯表
附錄Ⅰ 圖及說明
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3389686