發(fā)布時間：2021-09-07 14:07

　　目的本課題使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制小鼠ADAM9基因的表達,研究小鼠急性酒精性肝損傷過程中ADAM9基因的功能及其調(diào)控的分子機制。方法（1）在NCBI中搜索ADAM9相關(guān)的基因序列,并找出人鼠共有的ADAM9基因序列的外顯子和內(nèi)含子,在外顯子中查找人鼠相同CRISPR序列設計位點處的基因序列,構(gòu)建三個同時表達sgRNA、Puromycin和Cas9的三合一質(zhì)粒。（2）將3個質(zhì)粒以1:1:1的比例,加入小鼠成肌細胞培養(yǎng)皿中,并加入細胞轉(zhuǎn)染劑,對細胞進行轉(zhuǎn)染;繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞,待細胞濃度達到70%左右時,更換含有嘌呤霉素抗性的篩選培養(yǎng)基篩選耐藥陽性細胞;待形成穩(wěn)定的陽性克隆后,提取細胞DNA,進行測序比對,找出使細胞DNA產(chǎn)生突變的質(zhì)粒。（3）購買健康清潔級昆明雄性小鼠36只,用普通飼料喂養(yǎng)一周待小鼠適應環(huán)境后,隨機平均分為3組:正常組（Normal）12只,注射生理鹽水酒精灌胃組（saline+alcohol）12只,注射質(zhì)粒酒精灌胃組（ADAM9-sgRNA3+alcohol）12只。對照組小鼠不做任何處理,sgRNA組小鼠分別注入篩選出的活性質(zhì)粒,模型組小鼠尾靜脈注射等... 

【文章來源】：河南科技大學河南省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 酒精性肝損傷
        1.1.1 病理特點
        1.1.2 酒精性肝損傷動物模型
    1.2 酒精性肝損傷過程中分子調(diào)控機制研究
        1.2.1 CYP2E1與酒精性肝損傷
        1.2.2 應激分子與酒精性肝損傷
        1.2.3 TGF-βl與酒精性肝損傷
        1.2.4 肝細胞凋亡與酒精性肝損傷
    1.3 ADAM9介紹
    1.4 CRISPRCas9系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)與分類
        1.4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機理
        1.4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)清除外源性DNA原理
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建
        1.4.4 降低CRISPR/Cas技術(shù)基因編輯脫靶效率的研究
第2章 前言
第3章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞和質(zhì)粒
        3.1.2 實驗動物
        3.1.3 實驗儀器
        3.1.4 實驗試劑及溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 實驗設計
        3.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Adam9基因三合一質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 細菌培養(yǎng)
        3.2.4 質(zhì)粒提取
        3.2.5 細胞培養(yǎng)
        3.2.6 細胞轉(zhuǎn)染
        3.2.7 最佳嘌呤酶素濃度
        3.2.8 嘌呤酶素篩選
        3.2.9 PCR技術(shù)檢測
        3.2.10 小鼠尾靜脈注射
        3.2.11 動物實驗
        3.2.12 血清AST、ALT酶活性的檢測
        3.2.13 蠟塊包埋組織切片制作
        3.2.14 HE染色檢測各組小鼠的肝臟損傷情況
        3.2.15 PAS法檢測各組小鼠肝臟中糖原的表達情況
        3.2.16 Hoechst33258染色法檢測各組小鼠的肝細胞凋亡情況
        3.2.17 免疫印跡檢測蛋白的表達情況
    3.3 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析
第4章 結(jié)果
    4.1 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Adam9基因三合一質(zhì)粒
    4.2 C2C12細胞培養(yǎng)和sgRNA活性驗證
    4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的檢測結(jié)果
    4.4 肝臟組織HE染色結(jié)果
    4.5 肝臟組織PAS染色結(jié)果
    4.6 肝臟組織Hoechst33258染色結(jié)果
    4.7 免疫印跡法檢測組織蛋白的表達結(jié)果
第5章 討論
    5.1 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9與轉(zhuǎn)氨酶和組織損傷的關(guān)系
    5.2 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和糖原儲備的關(guān)系
    5.3 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和細胞凋亡的關(guān)系
    5.4 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9對肝細胞應激分子HSP27、HSP70的影響
    5.5 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9對肝細胞增殖的作用
    5.6 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和VEGF的關(guān)系
    5.7 小鼠急性酒精性肝損傷中ADAM9和IL-6信號途徑的關(guān)系
    5.8 問題與展望
第6章 結(jié)論
參考文獻
縮略語詞匯表
附錄Ⅰ 圖及說明
致謝
攻讀學位期間的研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Liver fibrosis and hepatic stellate cells: Etiology, pathological hallmarks and therapeutic targets[J]. Chong-Yang Zhang,Wei-Gang Yuan,Pei He,Jia-Hui Lei,Chun-Xu Wang.  World Journal of Gastroenterology. 2016(48)
[2]解整合素-金屬蛋白酶9在對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷中的表達分析[J]. 李三強,韓紅梅,盧華杰,席守民.  中國臨床藥理學雜志. 2015(12)
[3]瑞舒伐他汀抑制NF-κB活化下調(diào)LPS誘導小膠質(zhì)細胞TNF-α表達的實驗研究[J]. 馮社軍,王慧娟,李軍濤,武艷強.  西部醫(yī)學. 2014(11)
[4]New advances in molecular mechanisms and emerging therapeutic targets in alcoholic liver diseases[J]. Jessica A Williams,Sharon Manley,Wen-Xing Ding.  World Journal of Gastroenterology. 2014(36)
[5]Hepatic stellate cells and innate immunity in alcoholic liver disease[J]. Yang-Gun Suh,Won-Il Jeong.  World Journal of Gastroenterology. 2011(20)
[6]酒精性肝損傷實驗動物模型研究進展[J]. 陶倫.  中國醫(yī)學創(chuàng)新. 2011(05)
[7]Non-alcoholic steatohepatitis and influence of age and gender on histopathologic findings[J]. Nargess Ebrahimi Daryani,Nasser Ebrahimi Daryani,Seyed Moayed Alavian,Ali Zare,Seyed-Mohammad Fereshtehnejad,Mohammad Reza Keramati,Mohammad Reza Pashaei,Peiman Habibollahi.  World Journal of Gastroenterology. 2010(33)
[8]葛根散等3首解酒方對乙醇致小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 楊柱,田維毅,王文佳,韓潔.  遼寧中醫(yī)藥大學學報. 2010(04)
[9]實驗性肝損傷動物模型的制備和評價[J]. 曲相如,孫景春,盧秀花,胡婷婷,曹姍姍,曹霞.  中國實驗診斷學. 2009(10)
[10]肝動脈栓塞化療不同化療方案治療不可切除肝癌的前瞻性隨機對照研究[J]. 石明,陳繼安,林小軍,陳敏山,郭榮平,李升平,李錦清.  中國腫瘤臨床. 2009(01)



本文編號：3389686