肝纖維化是繼發(fā)于肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)的代償反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞的活化造成肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）過度沉積是導(dǎo)致肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。若得不到及時治療，肝纖維化會向肝硬化甚至肝癌發(fā)展。而近年來，基因治療以其靶向性高，給藥劑量低等優(yōu)勢逐漸成為藥物開發(fā)的新方向。開發(fā)抗肝纖維化基因藥物也成為治療肝纖維化的研究熱點(diǎn)�；谙傧嚓P(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）開發(fā)的基因治療載體——重組腺相關(guān)病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體，被認(rèn)為是最有前景的基因治療載體之一，并在臨床實(shí)驗(yàn)中取得了一定的成績。但其體內(nèi)基因表達(dá)效率太低是限制rAAV載體臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。而高劑量的rAAV基因藥物會引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。因此，rAAV基因藥物研究的當(dāng)務(wù)之急之一是提高其基因表達(dá)效率�；诖�，本論文設(shè)想尋找一種能夠進(jìn)一步提高rAAV載體轉(zhuǎn)染纖維化肝臟的有效手段來提高肝纖維化治療的有效性。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，RNAi極有可能是一種有效手段。本論文選用在肝纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的肝星狀細(xì)胞（L... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：138 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第1章 引言
    1.1 基因治療
        1.1.1 基因載體
        1.1.2 基因治療研究現(xiàn)狀
        1.1.3 基因治療的應(yīng)用障礙及應(yīng)對策略
    1.2 肝纖維化與基因治療
        1.2.1 肝纖維化概述
        1.2.2 抗肝纖維化治療現(xiàn)狀
    1.3 rAAV 與基因治療
        1.3.1 AAV 與 rAAV 載體
        1.3.2 rAAV 載體的轉(zhuǎn)染過程
        1.3.3 rAAV 基因藥物的臨床應(yīng)用
        1.3.4 rAAV 基因藥物存在的問題
        1.3.5 rAAV 載體表達(dá)效率優(yōu)化策略
    1.4 RNAi 與基因治療
        1.4.1 RNAi 與 miRNA
        1.4.2 miRNA 與病毒感染
    1.5 本課題的研究思路和論文結(jié)構(gòu)安排
第2章 促進(jìn) rAAV 表達(dá)效率的 miRNA 的篩選
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 主要溶液的配制
        2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇、凍存、培養(yǎng)與傳代
        2.2.3 轉(zhuǎn)染 miRNA
        2.2.4 rAAV 病毒轉(zhuǎn)染
        2.2.5 rAAV2‐Gluc 熒光檢測
        2.2.6 rAAV2‐EGFP 熒光檢測
        2.2.7 MTT 法檢測細(xì)胞存活率
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
        2.3.1 促進(jìn) rAAV 載體表達(dá)的 miRNA 的篩選
        2.3.2 對明星 miRNA 序列進(jìn)行再次篩選
    2.4 討論與小結(jié)
第3章 影響 rAAV 表達(dá)的細(xì)胞信號通路預(yù)測與分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 miRNA 靶基因的預(yù)測
        3.2.2 基因富集分析
        3.2.3 信號通路分析
        3.2.4 主要溶液的配制
        3.2.5 細(xì)胞復(fù)蘇、凍存、培養(yǎng)與傳代
        3.2.6 轉(zhuǎn)染 miRNA
        3.2.7 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA
        3.2.8 瓊脂糖電泳鑒定細(xì)胞總 RNA
        3.2.9 實(shí)時熒光定量 PCR 分析（qReal‐time PCR）
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 miRNA 靶基因預(yù)測及信號通路預(yù)測
        3.3.2 基因富集分析
        3.3.3 瓊脂糖電泳鑒定細(xì)胞總 RNA
        3.3.4 實(shí)時熒光定量 PCR 分析（qReal‐time PCR）
    3.4 討論與小結(jié)
第4章 總結(jié)與展望
    4.1 總結(jié)
    4.2 展望
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 A 初篩 miRNA 文庫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
附錄 B 備選 miRNA 預(yù)測靶基因 GO 分類的層次網(wǎng)絡(luò)
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3340451