目的:建立脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型,觀察促分化成熟脂肪細(xì)胞對肝細(xì)胞脂肪變及水通道蛋白9（aquaporin9,AQP9）表達(dá)的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。方法:首先,培養(yǎng)人前體脂肪細(xì)胞并促分化至完全成熟,將Hep G2細(xì)胞分別與未促分化脂肪細(xì)胞及促分化成熟脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)48h,分別標(biāo)記為對照組及實(shí)驗(yàn)組。對共培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride,TG）含量檢測,同時(shí)檢測磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）-絲蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase,Akt）信號通路變化及AQP9 m RNA和蛋白水平變化情況。隨后,實(shí)驗(yàn)組在共培養(yǎng)的同時(shí)加入100ng/ml PI3K-Akt通路激動(dòng)劑重組人胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）,標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組+IGF-1組,WB驗(yàn)證PI3K-Akt通路的激活,同時(shí)q RT-PCR和WB檢測AQP9的表達(dá)變化。其次,通過重組慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將Hep G2細(xì)胞進(jìn)行重組慢病毒LV-AQP9或... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：34 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

成熟脂肪細(xì)胞鑒定（×100）

圖 3 PI3K-Akt 通路激動(dòng)劑 IGF-1 可激活 PI3K-Akt 信號通路及下調(diào) AQP9 的表達(dá)A：qRT-PCR 檢測 HepG2 細(xì)胞中 AQP9 mRNA 表達(dá)；B：WB 檢測 HepG2 細(xì)胞中 AQP9、p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)。a與實(shí)驗(yàn)組比較 P<0.05Fig.3 PI3K-Akt pathway agonist IGF-1 can activate PI3K-Akt signaling pathwayand down-regulate the expression of AQP9A:qRT-PCR detected the expression of AQP9 mRNA in HepG2 cells;B:WB detected the expression of AQPp-Akt andAkt proteins in HepG2 cells.aCompared with the experimental group P<0.052.5 成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá) AQP9 的 HepG2 細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡下觀察兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)（圖 4A），轉(zhuǎn)染效率均>90%，HepG2-PWPI 組熒光圖片整個(gè)細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)的綠色熒光[圖 4A（b）]，而 HepG2-AQP9組熒光圖片可見綠色熒光主要分布在 HepG2-AQP9 細(xì)胞膜上[圖 4A（d）]。qRT-PC（圖 4B）和 WB（圖 4C）結(jié)果均提示 HepG2-AQP9 組中 AQP9 的 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著高于 HepG2-PWPI 組（P 值分別為 0.002、0.000），提示穩(wěn)定過表達(dá) AQP9 細(xì)胞

圖 4 構(gòu)建獲得穩(wěn)定過表達(dá) AQP9 的 HepG2 細(xì)胞及過表達(dá) AQP9 可促進(jìn)脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的 HepG2 細(xì)胞發(fā)生脂肪變A：激光共聚焦檢測 HepG2 細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)量（×200）（a：HepG2-PWPI 組白片，b：HepG2-PWPI 組光圖片，c：HepG2-AQP9 組白片，d：HepG2-AQP9 組熒光圖片）；B：qRT-PCR 檢測穩(wěn)定感染病毒的 HepG2胞中 AQP9 mRNA 的表達(dá)；C：WB 檢測穩(wěn)定感染病毒的 HepG2 細(xì)胞中 AQP9 蛋白的表達(dá)；D：HepG2-PWPI 共培組、HepG2-AQP9 共培養(yǎng)組細(xì)胞油紅 O 染色（×100），并檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。a與 HepG2-PWPI 組比P<0.05；b與 HepG2-PWPI 共培養(yǎng)組比較 P<0.05Fig.4 Construction of stable over-expression of AQP9 in HepG2 cells and over-expression of AQP9 canpromote steatosis in HepG2 cells co-cultured of adipocytesA: The expression of green fluorescent protein in HepG2 cells was detected by Laser confoca200)(a:HepG2-PWPI group white pictures,b:HepG2-PWPI group fluorescent pictures,c:HepG2-AQP9 growhite pictures,d: HepG2-AQP9 group fluorescent pictures ).B:qRT-PCR detected the expression of AQmRNA in HepG2 cells stably infected with virus;C:WB detected the expression of AQP9 protein in Hepcells stably infected with virus;D: The cells of HepG2-PWPI co-culture group and HepG2-AQP9 co-cultgroup were stained with oil red O (x100), and the contents of triglycerides were detected.acompared wHepG2-PWPI group P<0.05;bcompared with HepG2-PWPI co-culture group P<0.052.7 PI3K-Akt 通路激動(dòng)劑 IGF-1 可激活 PI3K-Akt 信號通路及下

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水甘油通道蛋白在非酒精性脂肪變性肝細(xì)胞模型中的表達(dá)及意義[J]. 邱烈旺,顧陸昀,呂琳,王奎,梅浙川.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2012(07)
[2]叉頭轉(zhuǎn)錄因子1基因沉默對水通道蛋白9在正常人肝細(xì)胞中表達(dá)的影響[J]. 肖瀟,梅浙川,邱烈旺,劉卉,呂琳.  中國生物制品學(xué)雜志. 2011(10)



本文編號：3334418