研究分為兩個(gè)部分:一、HBV cccDNA定量檢測(cè)方法的建立;二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同階段復(fù)制特點(diǎn)。一、HBV cccDNA定量檢測(cè)方法的建立目的:建立一種特異性、敏感性高的乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（HBVcccDNA）的定量檢測(cè)方法。方法:構(gòu)建含HBV目的序列的重組質(zhì)粒,利用HBV cccDNA的選擇性引物/探針（簡(jiǎn)稱(chēng)71F）以及總HBV DNA引物/探針（簡(jiǎn)稱(chēng)13F）建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),分析其靈敏度、重復(fù)性和線(xiàn)性范圍。進(jìn)一步利用重組質(zhì)粒、血清和肝組織DNA等不同模板優(yōu)選最佳PCR擴(kuò)增體系,其中依據(jù)模板的不同處理方法分為無(wú)酶切組、限制性?xún)?nèi)切酶酶切組、PSAD酶切組、限制性?xún)?nèi)切酶聯(lián)合PSAD酶切組,比較各組對(duì)HBV cccDNA檢測(cè)的特異性。結(jié)果:通過(guò)對(duì)已有特異性檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化,并針對(duì)特異性引物擴(kuò)增效率和PSAD酶切等環(huán)節(jié)進(jìn)行詳細(xì)探討,所建立的熒光定量檢測(cè)體系,HBV cccDNA特異性引物/探針及總HBV DNA引物/探針檢測(cè)靈敏度均達(dá)到10²拷貝/ml,兩對(duì)引物探針檢測(cè)線(xiàn)性范圍均為4×10²-4×10

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒構(gòu)象

A﹃﹃︺圖1一3.不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性分析。A為13F的重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(xiàn);B為7lF的重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(xiàn)。1.2.2.3兩對(duì)引物的擴(kuò)增效率分析參照Livak等人比較目標(biāo)序列和內(nèi)參序列擴(kuò)增效率的方法[‘41，利用13F與7lF在4x10”一4x102拷貝/mL范圍內(nèi)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值(圖1一2)，計(jì)算每一

cycleNUmberLogCOCD圖1一2.擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。A、B分別為13F的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);C、D分別為7lF的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)�；谥亟M質(zhì)粒的擴(kuò)增范圍，13F與7lF的空白及陰性對(duì)照始終保持檢測(cè)不到水平，因此，13F與7lF檢測(cè)下限定為1護(hù)拷貝/mL。此后的定量檢測(cè)采用4xl08一4x104拷貝/mL五個(gè)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1.2.2.2重復(fù)性分析批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn):選擇濃度為4x1o”~4x103拷貝/mL的梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別應(yīng)用13F、7lF進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每一濃度同時(shí)平行擴(kuò)增3次，其Ct值的CV值分別為13F<3%、7lF<3%(圖l一3)。批間重復(fù)實(shí)驗(yàn):選擇濃度為4xlo” ~4x103拷貝/mL的梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每一濃度分別使用13F、71F進(jìn)行7個(gè)不同批次的熒光定量PCR檢測(cè)，其Ct值的CV值分別為13F<4%、71F<3%。1.倪刊刃!日.伍

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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