目的：1．構(gòu)建中國(guó)地區(qū)流行的B基因型HBV可復(fù)制性克隆，驗(yàn)證其在體內(nèi)和體外的復(fù)制能力，為HBV復(fù)制相關(guān)研究及建立細(xì)胞和動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。2．將具有良好復(fù)制能力的B基因型中國(guó)株HBV可復(fù)制性克隆亞克隆到腺相關(guān)病毒載體內(nèi)，建立HBV慢性感染小鼠模型，同時(shí)建立A基因型HBV慢性感染小鼠模型。3．通過(guò)高壓尾靜脈注射的方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒和非病毒shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入到小鼠體內(nèi)，比較其抗HBV的時(shí)效，以期獲得較長(zhǎng)期的HBV抑制效果。方法：1．以一例中國(guó)HBV B基因型感染患者來(lái)源的全基因克隆為母板，使用SapⅠ將HBV基因組切下后在體外自身環(huán)化。使用環(huán)化后的基因組為模板分兩段分別擴(kuò)增HBV1.3倍基因組片段，依次將其連接到克隆載體pBluescriptⅡKS（+）上獲得含HBV1.3基因組的克隆。通過(guò)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系和高壓尾靜脈注射BAL B／cJ小鼠建立體外和體內(nèi)HBV復(fù)制模型，采用ELISA、Southern Blot、Northern Blot以及免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)HBV抗原分泌、復(fù)制中間體、轉(zhuǎn)錄子、抗原肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等情況，評(píng)價(jià)構(gòu)建克隆的復(fù)制能力。2．將復(fù)制能力良好的HBV1.3倍基... 

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【部分圖文】：

pBs一HBvl.3可復(fù)制性克隆構(gòu)建流程圖

N︶V6。山工…找lZd3d4ds轉(zhuǎn)染后天數(shù)轉(zhuǎn)染后HBSAgHBeAg分泌情況細(xì)胞的總DNA和RNA分別進(jìn)行S的第1、3、5天均可檢測(cè)到RC、D、2.4/2.IKb、O.7Kb的轉(zhuǎn)錄子。表DNA

A:感染性克隆注射組;B:感染性克隆注射組一抗空白;C:陽(yáng)性對(duì)照;D:生理鹽水注射組圖5.HBcAg在HBV急性感染小鼠模型肝臟中的表達(dá)情況(x200)構(gòu)建克隆高壓注射小鼠后第4天取肝組織檢測(cè)HBcAg表達(dá)情況，結(jié)果可見(jiàn)HBc小鼠肝細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，呈胞漿型和胞核型表達(dá)。而感染性克隆注射一抗空白水注射組沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。v急性感染小鼠模型血清中HBV分泌情況檢測(cè)一悶卜一HBVI.3質(zhì)粒組~對(duì)照組08︵6OnU1.+++﹄卜︺EE︸日nll︺八曰︵曰曰\s。藝。己1.OE+041.OE+02OE+00.-一一一一一一月.一一一~一.-.VOAZ山H

【參考文獻(xiàn)】：
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