第一部分?jǐn)y帶短發(fā)卡RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建和鑒定及AGR2表達(dá)沉默的食管腺癌SEG1穩(wěn)定細(xì)胞系的建立目的構(gòu)建攜帶短發(fā)卡RNA（shRNA）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，用該載體將shRNA導(dǎo)入SEG1細(xì)胞系，利用shRNA介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）沉默AGR2基因表達(dá)，建立AGR2表達(dá)沉默的SEG1穩(wěn)定細(xì)胞系。方法利用美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室RNA干擾數(shù)據(jù)庫(kù)信息設(shè)計(jì)針對(duì)AGR2的三種shRNA。將shRNA序列克隆至重組小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒（LMP）質(zhì)�？蚣軆�(nèi)。利用病毒包裝細(xì)胞系制各攜帶shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。采用低速離心法將攜帶shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染入SEG1細(xì)胞。用嘌呤霉素進(jìn)行藥物選擇，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄shRNA的SEG1細(xì)胞系。用實(shí)時(shí)定量PCR，Western-Blot法和細(xì)胞免疫化學(xué)DAB染色法從mRNA和蛋白水平比較三種shRNA抑制AGR2基因表達(dá)的程度。結(jié)果成功構(gòu)建攜帶shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：LMPAG1、LMPAG2和LMPAG3，以及空載體病毒LMPER。逆轉(zhuǎn)錄病毒成功感染SEG1細(xì)胞。建立起穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄三種不同shRNA的SEG1細(xì)胞系。三種shRNA序列（AG1，AG2和A... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

Xhol和Eco川雙酶切質(zhì)粒

若病毒成功感染SEGI細(xì)胞，則在熒光顯微鏡卜可觀察到SEGI細(xì)胞表達(dá)GFP。在嘿吟霉素抗藥性陽(yáng)性篩選24h后，約一70%SEGI細(xì)胞感染了LM以Gl逆轉(zhuǎn)錄病毒并表達(dá)GFP(圖3)。這表明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在SEGI細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且相當(dāng)高比例的SEGI細(xì)胞被成功感染。26

5ilencingefficieneyshownbyrealtimePCR604D20800一羅OO>一<2比E止閃O<LMPERLMPRAGILMPRAGZLMPRAG3定量PCR檢測(cè)不同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的SEGI穩(wěn)定細(xì)胞中為對(duì)照。


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