發(fā)布時間：2021-06-21 14:13

　　第一部分攜帶短發(fā)卡RNA的逆轉錄病毒載體構建和鑒定及AGR2表達沉默的食管腺癌SEG1穩(wěn)定細胞系的建立目的構建攜帶短發(fā)卡RNA（shRNA）的逆轉錄病毒載體，用該載體將shRNA導入SEG1細胞系，利用shRNA介導的RNA干擾（RNAi）沉默AGR2基因表達，建立AGR2表達沉默的SEG1穩(wěn)定細胞系。方法利用美國冷泉港實驗室RNA干擾數(shù)據(jù)庫信息設計針對AGR2的三種shRNA。將shRNA序列克隆至重組小鼠逆轉錄病毒（LMP）質�？蚣軆�。利用病毒包裝細胞系制各攜帶shRNA的重組逆轉錄病毒。采用低速離心法將攜帶shRNA的重組逆轉錄病毒轉染入SEG1細胞。用嘌呤霉素進行藥物選擇，建立穩(wěn)定轉錄shRNA的SEG1細胞系。用實時定量PCR，Western-Blot法和細胞免疫化學DAB染色法從mRNA和蛋白水平比較三種shRNA抑制AGR2基因表達的程度。結果成功構建攜帶shRNA的重組逆轉錄病毒載體：LMPAG1、LMPAG2和LMPAG3，以及空載體病毒LMPER。逆轉錄病毒成功感染SEG1細胞。建立起穩(wěn)定轉錄三種不同shRNA的SEG1細胞系。三種shRNA序列（AG1，AG2和A... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

Xhol和Eco川雙酶切質粒

若病毒成功感染SEGI細胞，則在熒光顯微鏡卜可觀察到SEGI細胞表達GFP。在嘿吟霉素抗藥性陽性篩選24h后，約一70%SEGI細胞感染了LM以Gl逆轉錄病毒并表達GFP(圖3)。這表明逆轉錄病毒載體可在SEGI細胞內正常轉錄和表達，且相當高比例的SEGI細胞被成功感染。26

5ilencingefficieneyshownbyrealtimePCR604D20800一羅OO>一<2比E止閃O<LMPERLMPRAGILMPRAGZLMPRAG3定量PCR檢測不同逆轉錄病毒載體感染的SEGI穩(wěn)定細胞中為對照。


本文編號：3240823