背景急性肝損傷（Acute Liver Injury,ALI）是由藥物、毒物或病毒等物質(zhì)引起的肝細(xì)胞變性、壞死,病情進(jìn)展較快,可迅速發(fā)展為急性肝衰竭,內(nèi)科綜合治療臨床病死率高達(dá)70%。由各種病因?qū)е碌腁LI,肝臟損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于病因本身造成的損傷。研究表明,ALI時(shí)肝細(xì)胞壞死激活了肝臟免疫系統(tǒng),進(jìn)一步加重了肝臟的損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用。MSCs移植治療ALI的療效,已經(jīng)在多種動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中得到證實(shí),有望成為新的替代治療手段。研究表明MSCs主要通過(guò)調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用。但是,由于傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)存在檢測(cè)通道受限和熒光素發(fā)射光譜重疊的技術(shù)瓶頸,現(xiàn)在對(duì)于MSCs移植治療ALI的免疫調(diào)節(jié)作用的研究主要局限在單個(gè)或幾個(gè)免疫細(xì)胞亞群上。但是,免疫系統(tǒng)是由多種細(xì)胞和分子組成的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò),研究MSCs移植治療ALI對(duì)整個(gè)肝臟免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是非常必要的。質(zhì)譜流式技術(shù)由Tanner和他的同事在2009首次提出,突破了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)瓶頸,采用金屬同位素替代熒光素作為探針偶聯(lián)抗... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟免疫細(xì)胞的純度和活率(CD45+代表免疫細(xì)胞,PI-代表活細(xì)胞)。

我們選擇了涵蓋CD4+T細(xì)胞亞群、CD8+T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞亞群、常駐肝臟NK細(xì)胞、傳統(tǒng)NK細(xì)胞(Conventional NK,c NK)、漿細(xì)胞DC(plasmacytoid DC,pDC)、以及傳統(tǒng)DC、單核巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的譜系特異性表面標(biāo)志物,以及功能分子:轉(zhuǎn)錄因子,如FOXP3;趨化因子受體,如CXCR3,CX3CR1;細(xì)胞因子受體,如CD127,CD25;協(xié)同刺激分子,如Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen-4(CTLA-4),ICOS;協(xié)同刺激分子配體,如CD80;粘附分子,如CD62L,CD44;細(xì)胞增殖標(biāo)志物,如KI-67等共43個(gè)抗體,根據(jù)金屬同位素在質(zhì)譜流式機(jī)器上的信號(hào)強(qiáng)度和敏感性以及所檢測(cè)抗體在免疫細(xì)胞上的豐度,以使通道之間信號(hào)干擾最小為原則,進(jìn)行金屬同位素和抗體匹配的通道設(shè)計(jì)(表1-1),然后使用MAXPAR×8抗體標(biāo)記試劑盒偶聯(lián)抗體與金屬同位素,制備質(zhì)譜流式抗體。將制備成功的質(zhì)譜流式抗體調(diào)整至統(tǒng)一濃度,在100μL含有5×106個(gè)CD45+細(xì)胞EP管內(nèi)依次加入1μL、0.5μL、0.25μL、0.125μL和0μL的抗體,以優(yōu)化質(zhì)譜流式抗體使用劑量。為了準(zhǔn)確方便的進(jìn)行質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)的分析比較,我們采用金屬barcode對(duì)采用不同劑量抗體孵育的樣本進(jìn)行標(biāo)記,同時(shí)上機(jī)檢測(cè)和分析以減少技術(shù)誤差。我們以可以明顯區(qū)分陽(yáng)性信號(hào)且使抗體用量達(dá)到飽和狀態(tài)的最低劑量為最佳抗體使用劑量,例如:158Gd-CD3抗體使用劑量檢測(cè)(圖1-2),在抗體用量為1μL時(shí),陽(yáng)性信號(hào)與陰性信號(hào)區(qū)分最為明顯,故在5×106個(gè)CD45+細(xì)胞/100μL的反應(yīng)體系內(nèi)158Gd-CD3抗體使用劑量為1μL。在5×106個(gè)CD45+細(xì)胞/100μL的反應(yīng)體系中,每個(gè)抗體的具體使用劑量見(jiàn)表1-1。多色流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證質(zhì)譜流式的準(zhǔn)確性

目前對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)主要依賴于流式細(xì)胞術(shù),質(zhì)譜流式技術(shù)目前還沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用,因此我們用主要免疫細(xì)胞亞群(CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD49b+NK細(xì)胞和CD11b+髓系細(xì)胞)譜系特異性標(biāo)志物抗體,對(duì)肝臟免疫細(xì)胞分別進(jìn)行質(zhì)譜流式(圖1-3A)和多色流式(圖1-3B)檢測(cè)分析,將質(zhì)譜流式和多色流式檢測(cè)到的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和髓系細(xì)胞占CD45+細(xì)胞的百分比進(jìn)行比較,結(jié)果表明,兩種檢測(cè)手段所得的結(jié)果沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如圖1-3C)。手動(dòng)設(shè)門(mén)驗(yàn)證高維數(shù)據(jù)分析方法的可行性


本文編號(hào)：3213626