目的:探究酒精對(duì)人肝L02細(xì)胞的損傷作用及Nrf2在酒精致肝細(xì)胞損傷過程中的作用機(jī)制。方法:用RNA干擾的方法下調(diào)L02細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá),用于轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞的Nrf2-si RNA序列是,sense:5’-CCAGAACACUCAGUGGAAUTT-3’;antisense:5’-AUUCCACUGAGUGUUCUGGTT-3’。用RT-PCR法檢測(cè)L02細(xì)胞內(nèi)Nrf2在m RNA水平的表達(dá),Western blot法檢測(cè)L02細(xì)胞內(nèi)Nrf2在蛋白水平的表達(dá)。MTT法檢測(cè)L02細(xì)胞生存率的變化。比色法檢測(cè)L02細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性。羥胺法檢測(cè)L02細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）的活性。DCFH-DA染色熒光顯微鏡觀察L02細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量和分布,DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀定量測(cè)定L02細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。DAPI染色熒光顯微鏡觀察L02細(xì)胞核形態(tài)的改變并由此判斷細(xì)胞凋亡的變化。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果:1.用不同濃度酒精處理L02細(xì)胞24 h,MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示,與0mmol/L酒... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

酒精對(duì)L02細(xì)胞生存率的影響（x±s,n=5）

Nrf2在酒精致L02細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究223.2不同濃度酒精對(duì)L02細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量的影響用含不同濃度酒精的去血清培養(yǎng)液處理L02細(xì)胞3h，對(duì)照組的培養(yǎng)液含血清不加酒精。提取細(xì)胞質(zhì)蛋白后，Westernblot法檢測(cè)，結(jié)果如圖3-2所示，與0mmol/L酒精組相比，隨著酒精濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)量減少。圖3-2酒精對(duì)L02細(xì)胞胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)量的影響（x±s,n=3）3.3不同濃度酒精對(duì)L02細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量的影響將L02細(xì)胞用含不同濃度酒精的去血清培養(yǎng)液處理3h，對(duì)照組的培養(yǎng)液含血清不加酒精。提取細(xì)胞核蛋白后，Westernblot法檢測(cè)，結(jié)果如圖3-3所示，與0mmol/L酒精組相比，隨著酒精濃度的增加，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)量增多。酒精(mmol/L)-actinControl0100200400Nrf242KD100KD酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2-actin42KD100KD

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果23圖3-3酒精對(duì)L02細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量的影響（x±s,n=3）3.4siRNA載體的構(gòu)建與表達(dá)檢測(cè)將培養(yǎng)的L02細(xì)胞分為對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（GAPDH-siRNA）以及Nrf2-siRNA實(shí)驗(yàn)組，用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。相應(yīng)的試劑處理L02細(xì)胞24h，提取RNA，用RT-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平的變化；處理48h，提取蛋白質(zhì)，用Westernblot法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。3.4.1RT-PCR檢測(cè)mRNA水平變化如圖所示（圖3-4），與對(duì)照組相比，Nrf2siRNA實(shí)驗(yàn)組的Nrf2mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)，其他組的Nrf2mRNA的表達(dá)量沒有明顯的變化。作為內(nèi)參基因的GAPDH-siRNA陽性對(duì)照組GAPDHmRNA表達(dá)量明顯下調(diào)，表明實(shí)驗(yàn)過程中轉(zhuǎn)染、RNA提取及檢測(cè)方法的可靠性和有效性。酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2LaminB168KD100KD酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2LaminB168KD100KD

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HBV感染患者氧化應(yīng)激狀態(tài)與病毒基因型和耐藥突變的相關(guān)性[J]. 楊渝偉,陳小紅,彭玲,唐潔,俸家富.  檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床. 2018(04)
[2]Nrf2在神經(jīng)退行性疾病中的作用及激活劑的研究進(jìn)展[J]. 趙春陽,王曉良,彭英.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2015(04)
[3]Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J]. Elisabetta Ceni,Tommaso Mello,Andrea Galli.  World Journal of Gastroenterology. 2014(47)
[4]Oxidative stress as a crucial factor in liver diseases[J]. Halina Cichoz-Lach,Agata Michalak.  World Journal of Gastroenterology. 2014(25)
[5]Nrf2/ARE信號(hào)通路及其調(diào)控的抗氧化蛋白[J]. 李航,段惠軍.  中國藥理學(xué)通報(bào). 2011(03)

碩士論文
[1]酒精致肝L02細(xì)胞損傷與Nrf2通路關(guān)系研究[D]. 李曉華.河南大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3068470