乙型肝炎病毒是一種具有嗜肝性的,不引起細(xì)胞病變的DNA病毒,大約5-10%的成人感染和90-95%的新生胎兒感染會(huì)轉(zhuǎn)為持續(xù)的感染。這些持續(xù)的感染人群具有極大地危險(xiǎn)轉(zhuǎn)化為慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。乙型肝炎病毒侵染導(dǎo)致的疾病已經(jīng)成為了一種世界范圍內(nèi)的主要健康問題。雖然治療性的核苷類似物和干擾素被用于乙型肝炎病毒感染者的治療,但是乙型肝炎感染者人數(shù)和乙型肝炎相關(guān)的死亡人數(shù)逐年遞增。因此,發(fā)展新的治療藥物或備選資源十分重要。本實(shí)驗(yàn)室近期從蝎毒腺cDNA文庫(kù)中篩選得到了一些陽離子宿主防御肽基因。根據(jù)這些基因序列化學(xué)合成多肽,并且測(cè)試了它們的抗乙型肝炎病毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)尖狼蝎活性多肽Mucroporin-M1能夠有效的抑制乙型肝炎病毒表面抗原和早期抗原的表達(dá)。因此,對(duì)蝎活性多肽Mucroporin-Ml的抗HBV作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。首先在乙型肝炎病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系HepG2.2.15中檢測(cè)了Mucroporin-M1對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示,Mucroporin-M1能夠濃度依賴性的抑制乙型肝炎病毒表面抗原,早期抗原以及病毒子代DNA在細(xì)胞上清中的表達(dá)和復(fù)制。與此同時(shí),在HepG2... 

【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 HBV的研究概況
        1.1 HBV病毒以及在體內(nèi)外的感染
            1.1.1 HBV的結(jié)構(gòu)與組成
            1.1.2 HBV傳播模式和宿主范圍
            1.1.3 HBV的體內(nèi)外感染
        1.2 HBV復(fù)制周期
            1.2.1 吸附和進(jìn)入
            1.2.2 松弛環(huán)狀DNA的入核
            1.2.3 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的形成和維持
            1.2.4 病毒RNA復(fù)制
            1.2.5 病毒子代DNA合成
        1.3 乙型肝炎的治療與研究
    2 MAPK-HNF4α通路與與HBV復(fù)制的相互關(guān)系
        2.1 MAPK-ERK通路
        2.2 MAPK-JNK通路
        2.3 MAPK-p38通路
        2.4 MAPK-HNF4α通路與HBV復(fù)制的關(guān)系
    3 陽離子宿主防御肽抗病毒研究概況
    4 本工作出發(fā)點(diǎn)
第二章 抗HBV多肽Mucroporin-M1的篩選
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料,試劑和儀器
            2.2.1.1 細(xì)胞系
            2.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基以及相關(guān)溶液配制
            2.2.1.3 蝎毒素多肽的合成
            2.2.1.4 Elisa試劑盒
            2.2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2.2 多肽抑制HBV活性篩選
            2.2.2.3 多肽序列分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 Mucroporin-M1以及其他多肽的分離鑒定
        2.3.2 抗HBV多肽Mucroporin-M1的鑒定
    2.4 討論
第三章 Mucroporin-M1多肽體外抑制HBV的復(fù)制
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料,試劑和儀器
            3.2.1.1 細(xì)胞系
            3.2.1.2 質(zhì)粒
            3.2.1.3 抗體
            3.2.1.4 試劑和試劑盒
            3.2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)制備
            3.2.2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)
            3.2.2.3 細(xì)胞上清HBeAg和HBsAg檢測(cè)
            3.2.2.4 細(xì)胞上清中的HBV DNA檢測(cè)
            3.2.2.5 Western blot檢測(cè)HBV Core蛋白
            3.2.2.6 Northern blot 檢測(cè) HBV RNA
            3.2.2.7 Southern blot 檢測(cè) HBV DNA
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
        3.3.2 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞上清中病毒的抑制效應(yīng)
            3.3.2.1 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞上清中HBeAg和HBsAg的抑制效應(yīng)
            3.3.2.2 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞上清中HBV DNA的抑制效應(yīng)
        3.3.3 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV病毒的抑制
            3.3.3.1 Mucroporin-M1抑制細(xì)胞內(nèi)HBV Core蛋白的表達(dá)
            3.3.3.2 Mucroporin-M1對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的濃度依賴抑制效應(yīng)
            3.3.3.3 Mucroporin-M1抑制細(xì)胞內(nèi)HBV RNA的表達(dá)
    3.4 討論
第四章 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料,試劑和儀器
            4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            4.2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型構(gòu)建及多肽處理
            4.2.2.2 小鼠血液中HBeAg和HBsAg抗原檢測(cè)
            4.2.2.3 組織切片和免疫組化
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 Mucroporin-M1多肽對(duì)小鼠血清中HBeAg和HBsAg的抑制
        4.3.2 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)
    4.4 討論
第五章 Mucroporin-M1體外抑制HBV復(fù)制的作用機(jī)制
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料,試劑和儀器
            5.2.1.1 質(zhì)粒
            5.2.1.2 試劑
            5.2.1.3 試劑盒
            5.2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            5.2.2.1 細(xì)胞總RNA的提取
            5.2.2.2 cDNA一鏈的反轉(zhuǎn)錄合成
            5.2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR
            5.2.2.4 超純質(zhì)粒的提取
            5.2.2.5 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
            5.2.2.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)
            5.2.2.7 Western blot檢測(cè)HNF4α
            5.2.2.8 細(xì)胞MAPK通路的檢測(cè)
            5.2.2.9 MAPK抑制劑對(duì)HBV DNA影響的檢測(cè)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 Mucroprin-M1多肽抑制HBV病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性
        5.3.2 Mucroprin-M1對(duì)反式轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合HBV啟動(dòng)子順式元件的影響
        5.3.3 Mucroprin-M1抑制HNF4α的表達(dá)
        5.3.4 Mucroprin-M1對(duì)MAPK通路的激活作用
        5.3.5 MAPK通路抑制劑對(duì)Mucropr in-M1激活MAPK通路作用的阻斷
    5.4 討論
第六章 Mucroporin-M1抑制小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制的作用機(jī)制
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料,試劑和儀器
            6.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            6.2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            6.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型構(gòu)建及多肽處理
            6.2.2.2 小鼠肝臟細(xì)胞蛋白提取和制樣
            6.2.2.3 Western blot檢測(cè)MAPK蛋白和HBV Core蛋白
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    6.4 討論
實(shí)驗(yàn)總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
博士期間發(fā)表論文以及獲得專利
致謝



本文編號(hào)：3008489