乙型肝炎病毒是一種具有嗜肝性的,不引起細胞病變的DNA病毒,大約5-10%的成人感染和90-95%的新生胎兒感染會轉(zhuǎn)為持續(xù)的感染。這些持續(xù)的感染人群具有極大地危險轉(zhuǎn)化為慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。乙型肝炎病毒侵染導致的疾病已經(jīng)成為了一種世界范圍內(nèi)的主要健康問題。雖然治療性的核苷類似物和干擾素被用于乙型肝炎病毒感染者的治療,但是乙型肝炎感染者人數(shù)和乙型肝炎相關的死亡人數(shù)逐年遞增。因此,發(fā)展新的治療藥物或備選資源十分重要。本實驗室近期從蝎毒腺cDNA文庫中篩選得到了一些陽離子宿主防御肽基因。根據(jù)這些基因序列化學合成多肽,并且測試了它們的抗乙型肝炎病毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細尖狼蝎活性多肽Mucroporin-M1能夠有效的抑制乙型肝炎病毒表面抗原和早期抗原的表達。因此,對蝎活性多肽Mucroporin-Ml的抗HBV作用進行了進一步的研究。首先在乙型肝炎病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HepG2.2.15中檢測了Mucroporin-M1對乙型肝炎病毒復制的抑制效應。結(jié)果顯示,Mucroporin-M1能夠濃度依賴性的抑制乙型肝炎病毒表面抗原,早期抗原以及病毒子代DNA在細胞上清中的表達和復制。與此同時,在HepG2... 

【文章來源】：武漢大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 HBV的研究概況
        1.1 HBV病毒以及在體內(nèi)外的感染
            1.1.1 HBV的結(jié)構(gòu)與組成
            1.1.2 HBV傳播模式和宿主范圍
            1.1.3 HBV的體內(nèi)外感染
        1.2 HBV復制周期
            1.2.1 吸附和進入
            1.2.2 松弛環(huán)狀DNA的入核
            1.2.3 共價閉合環(huán)狀DNA的形成和維持
            1.2.4 病毒RNA復制
            1.2.5 病毒子代DNA合成
        1.3 乙型肝炎的治療與研究
    2 MAPK-HNF4α通路與與HBV復制的相互關系
        2.1 MAPK-ERK通路
        2.2 MAPK-JNK通路
        2.3 MAPK-p38通路
        2.4 MAPK-HNF4α通路與HBV復制的關系
    3 陽離子宿主防御肽抗病毒研究概況
    4 本工作出發(fā)點
第二章 抗HBV多肽Mucroporin-M1的篩選
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料,試劑和儀器
            2.2.1.1 細胞系
            2.2.1.2 細胞培養(yǎng)基以及相關溶液配制
            2.2.1.3 蝎毒素多肽的合成
            2.2.1.4 Elisa試劑盒
            2.2.1.5 實驗儀器
        2.2.2 實驗方法
            2.2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2.2 多肽抑制HBV活性篩選
            2.2.2.3 多肽序列分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 Mucroporin-M1以及其他多肽的分離鑒定
        2.3.2 抗HBV多肽Mucroporin-M1的鑒定
    2.4 討論
第三章 Mucroporin-M1多肽體外抑制HBV的復制
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料,試劑和儀器
            3.2.1.1 細胞系
            3.2.1.2 質(zhì)粒
            3.2.1.3 抗體
            3.2.1.4 試劑和試劑盒
            3.2.1.5 實驗儀器
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)制備
            3.2.2.2 細胞毒性檢測
            3.2.2.3 細胞上清HBeAg和HBsAg檢測
            3.2.2.4 細胞上清中的HBV DNA檢測
            3.2.2.5 Western blot檢測HBV Core蛋白
            3.2.2.6 Northern blot 檢測 HBV RNA
            3.2.2.7 Southern blot 檢測 HBV DNA
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 Mucroporin-M1對細胞生長的影響
        3.3.2 Mucroporin-M1對細胞上清中病毒的抑制效應
            3.3.2.1 Mucroporin-M1對細胞上清中HBeAg和HBsAg的抑制效應
            3.3.2.2 Mucroporin-M1對細胞上清中HBV DNA的抑制效應
        3.3.3 Mucroporin-M1對細胞內(nèi)HBV病毒的抑制
            3.3.3.1 Mucroporin-M1抑制細胞內(nèi)HBV Core蛋白的表達
            3.3.3.2 Mucroporin-M1對細胞內(nèi)HBV DNA的濃度依賴抑制效應
            3.3.3.3 Mucroporin-M1抑制細胞內(nèi)HBV RNA的表達
    3.4 討論
第四章 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠體內(nèi)HBV的復制
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料,試劑和儀器
            4.2.1.1 實驗動物
            4.2.1.2 實驗試劑和材料
        4.2.2 實驗方法
            4.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型構(gòu)建及多肽處理
            4.2.2.2 小鼠血液中HBeAg和HBsAg抗原檢測
            4.2.2.3 組織切片和免疫組化
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 Mucroporin-M1多肽對小鼠血清中HBeAg和HBsAg的抑制
        4.3.2 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠肝細胞中HBcAg的表達
    4.4 討論
第五章 Mucroporin-M1體外抑制HBV復制的作用機制
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實驗材料,試劑和儀器
            5.2.1.1 質(zhì)粒
            5.2.1.2 試劑
            5.2.1.3 試劑盒
            5.2.1.4 實驗儀器
        5.2.2 實驗方法
            5.2.2.1 細胞總RNA的提取
            5.2.2.2 cDNA一鏈的反轉(zhuǎn)錄合成
            5.2.2.3 實時定量PCR
            5.2.2.4 超純質(zhì)粒的提取
            5.2.2.5 雙熒光素酶實驗
            5.2.2.6 凝膠阻滯實驗
            5.2.2.7 Western blot檢測HNF4α
            5.2.2.8 細胞MAPK通路的檢測
            5.2.2.9 MAPK抑制劑對HBV DNA影響的檢測
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 Mucroprin-M1多肽抑制HBV病毒啟動子轉(zhuǎn)錄活性
        5.3.2 Mucroprin-M1對反式轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合HBV啟動子順式元件的影響
        5.3.3 Mucroprin-M1抑制HNF4α的表達
        5.3.4 Mucroprin-M1對MAPK通路的激活作用
        5.3.5 MAPK通路抑制劑對Mucropr in-M1激活MAPK通路作用的阻斷
    5.4 討論
第六章 Mucroporin-M1抑制小鼠體內(nèi)HBV復制的作用機制
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 實驗材料,試劑和儀器
            6.2.1.1 實驗動物
            6.2.1.2 實驗試劑和材料
        6.2.2 實驗方法
            6.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型構(gòu)建及多肽處理
            6.2.2.2 小鼠肝臟細胞蛋白提取和制樣
            6.2.2.3 Western blot檢測MAPK蛋白和HBV Core蛋白
    6.3 實驗結(jié)果
    6.4 討論
實驗總結(jié)與展望
參考文獻
博士期間發(fā)表論文以及獲得專利
致謝



本文編號：3008489