目的1.克隆小鼠的TIM-3基因,建立原核表達(dá)載體。2.原核表達(dá)該分子,制備相應(yīng)的多克隆抗體并初步鑒定。方法1.以BALB/c小鼠的脾細(xì)胞總RNA為模板,應(yīng)用RT-PCR方法,擴(kuò)增得到TIM-3的胞外段序列,與pRSET-B載體連接。2.將pRSET-B-TIM-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Roseeta（DE3）中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用western blot方法檢測(cè)重組蛋白的抗原性。通過(guò)Ni-NTA柱的方法純化重組蛋白,將純化的重組蛋白免疫家兔,制備多克隆抗體,并用ELISA、western blot,免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)抗體的效價(jià)與特異性。結(jié)果1.使用RT-PCR技術(shù),從BALB/c小鼠的脾細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到約510bp的TIM-3基因的胞外段,與pRSET-B載體連接,對(duì)重組體進(jìn)行PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序分析表明:成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pRSET-B-TIM-3。2.重組質(zhì)粒的TIM-3蛋白在Rosseta（DE3）中經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo),以包涵體的形式高效表達(dá)。通過(guò)western blot分析,證實(shí)了約25KD的目的蛋白。3.用Ni-NTA鎳柱純化重組的TIM-3蛋白常... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠TIM-3RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定和雙酶切鑒定結(jié)果：以轉(zhuǎn)化 pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒的菌液為模板，以 RT-PCR 的引物擴(kuò)增出約片段，與 RT-PCR 擴(kuò)增的片段大小一致，說(shuō)明 pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 2-1）；pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò) BamH I 和 Hind III 雙酶切后，產(chǎn)生 2 個(gè)約為 900bp，另一個(gè)大于 2000bp，其中小的片段與前述 PCR 產(chǎn)物大小一目的片段已經(jīng)正確插入 pMD18-T 載體（見(jiàn)圖 2-2）。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定和雙酶切鑒定結(jié)果：以轉(zhuǎn)化 pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒的菌液為模板，以 RT-PCR 的引物擴(kuò)增出約片段，與 RT-PCR 擴(kuò)增的片段大小一致，說(shuō)明 pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 2-1）；pMD18-T-TIM-3 重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò) BamH I 和 Hind III 雙酶切后，產(chǎn)生 2 個(gè)約為 900bp，另一個(gè)大于 2000bp，其中小的片段與前述 PCR 產(chǎn)物大小一目的片段已經(jīng)正確插入 pMD18-T 載體（見(jiàn)圖 2-2）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Current treatment indications and strategies in chronic hepatitis B virus infection[J]. George V Papatheodoridis,Spilios Manolakopoulos,Athanasios J Archimandritis.  World Journal of Gastroenterology. 2008(45)



本文編號(hào)：2980787