戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E，HE）的病原體，主要經(jīng)糞口途徑傳播。HEV為單股正鏈無(wú)包膜RNA病毒，基因組長(zhǎng)約7.2Kb，包含三個(gè)開放編碼區(qū)，ORF1、ORF2、ORF3，其中ORF2蛋白為病毒衣殼的主要成份，衣殼蛋白與宿主細(xì)胞的特異性結(jié)合啟動(dòng)HEV的復(fù)制過(guò)程，是決定HEV對(duì)宿主細(xì)胞親嗜性的首要步驟。哺乳動(dòng)物HEV有4個(gè)基因型（1-4型），4種型別之間HEV核苷酸序列的相似性在80%左右，但宿主范圍有一定差異，1型和2型HEV只感染人，3型和4型HEV既感染人也感染豬，并且豬是其主要的儲(chǔ)存宿主。本課題擬通過(guò)對(duì)HEV與豬肝蛋白相互作用的研究，篩選并確認(rèn)與HEV有特異性結(jié)合作用的豬肝蛋白，分析這些蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用，進(jìn)一步通過(guò)比較基因1型、4型HEV與豬肝蛋白結(jié)合能力的差異，分析HEV宿主限制性及跨種屬感染的機(jī)制。我們利用分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，分別以基因1型HEV ORF2和基因4型HEVORF2蛋白為誘餌對(duì)豬肝臟cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)三次文庫(kù)篩選，運(yùn)用酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)去除酵母雙雜交假陽(yáng)性結(jié)果，得到與1型HEV ... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)食品藥品檢定研究院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
主要中英文縮寫詞
中文摘要
Abstract
一 前言
    1.1 HEV 的基本病毒學(xué)特性
    1.2 HEV 基因型及不同基因型的地理分布
    1.3 HEV 在動(dòng)物中的流行、傳播途徑及跨種屬感染的潛在可能
    1.4 本課題的研究目的和內(nèi)容
二 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器
    2.1 材料
        2.1.1 酵母雙雜交系統(tǒng)
        2.1.2 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀系統(tǒng)
    2.2 試劑及配制
        2.2.1 試劑
        2.2.2 試劑配制
    2.3 儀器
三 實(shí)驗(yàn)技術(shù)
    3.1 分裂‐泛素酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)
    3.2 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀技術(shù)
四 實(shí)驗(yàn)方法
    4.1 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
        4.1.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及擴(kuò)增
        4.1.2 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告株 NMY51
        4.1.3 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒功能性驗(yàn)證
        4.1.4 酵母雙雜交篩選壓力的確定
        4.1.5 酵母雙雜交篩選豬肝臟 cDNA 文庫(kù)
        4.1.6 陽(yáng)性克隆的確認(rèn)以及捕獲質(zhì)粒的提取
        4.1.7 酵母雙雜交共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
        4.1.8 對(duì) pPR3N-Prey 中的捕獲基因進(jìn)行測(cè)序和序列分析
    4.2 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
        4.2.1 pAcGFP1‐Bait 和 pProlabel‐Prey 質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 AcGFP1‐Bait 和 ProLabel‐Prey 共轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞
        4.2.3 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
    4.3 ORF2 蛋白與肝細(xì)胞相互作用蛋白的生物信息學(xué)分析
五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    5.1 酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.1.1 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒大量提取后鑒定及定量
        5.1.2 酵母報(bào)告株 NMY51 轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒后菌落 PCR 鑒定
        5.1.3 誘餌質(zhì)粒功能性驗(yàn)證
        5.1.4 酵母雙雜交文庫(kù)篩選壓力選擇
        5.1.5 酵母雙雜交篩選與 HEV ORF2 相互作用的豬肝細(xì)胞文庫(kù)
        5.1.6 捕獲蛋白亞細(xì)胞定位
    5.2 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀
        5.2.1 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.2 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀質(zhì)粒表達(dá)鑒定
        5.2.3 化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀結(jié)果
        5.2.4 相互作用蛋白功能富集聚類分析
        5.2.5 捕獲蛋白與基因 1 型、4 型 HEV ORF2 結(jié)合力的比較
討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
論文綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：2932405