戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E，HE）的病原體，主要經(jīng)糞口途徑傳播。HEV為單股正鏈無包膜RNA病毒，基因組長約7.2Kb，包含三個開放編碼區(qū)，ORF1、ORF2、ORF3，其中ORF2蛋白為病毒衣殼的主要成份，衣殼蛋白與宿主細胞的特異性結合啟動HEV的復制過程，是決定HEV對宿主細胞親嗜性的首要步驟。哺乳動物HEV有4個基因型（1-4型），4種型別之間HEV核苷酸序列的相似性在80%左右，但宿主范圍有一定差異，1型和2型HEV只感染人，3型和4型HEV既感染人也感染豬，并且豬是其主要的儲存宿主。本課題擬通過對HEV與豬肝蛋白相互作用的研究，篩選并確認與HEV有特異性結合作用的豬肝蛋白，分析這些蛋白在病毒復制過程中的作用，進一步通過比較基因1型、4型HEV與豬肝蛋白結合能力的差異，分析HEV宿主限制性及跨種屬感染的機制。我們利用分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，分別以基因1型HEV ORF2和基因4型HEVORF2蛋白為誘餌對豬肝臟cDNA文庫進行篩選，經(jīng)過三次文庫篩選，運用酵母共轉化實驗去除酵母雙雜交假陽性結果，得到與1型HEV ... 

【文章來源】：中國食品藥品檢定研究院北京市

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
主要中英文縮寫詞
中文摘要
Abstract
一 前言
    1.1 HEV 的基本病毒學特性
    1.2 HEV 基因型及不同基因型的地理分布
    1.3 HEV 在動物中的流行、傳播途徑及跨種屬感染的潛在可能
    1.4 本課題的研究目的和內容
二 實驗材料、試劑和儀器
    2.1 材料
        2.1.1 酵母雙雜交系統(tǒng)
        2.1.2 化學發(fā)光免疫共沉淀系統(tǒng)
    2.2 試劑及配制
        2.2.1 試劑
        2.2.2 試劑配制
    2.3 儀器
三 實驗技術
    3.1 分裂‐泛素酵母雙雜交實驗技術
    3.2 化學發(fā)光免疫共沉淀技術
四 實驗方法
    4.1 酵母雙雜交實驗
        4.1.1 誘餌質粒的構建及擴增
        4.1.2 誘餌質粒轉化酵母報告株 NMY51
        4.1.3 酵母雙雜交誘餌質粒功能性驗證
        4.1.4 酵母雙雜交篩選壓力的確定
        4.1.5 酵母雙雜交篩選豬肝臟 cDNA 文庫
        4.1.6 陽性克隆的確認以及捕獲質粒的提取
        4.1.7 酵母雙雜交共轉化實驗
        4.1.8 對 pPR3N-Prey 中的捕獲基因進行測序和序列分析
    4.2 化學發(fā)光免疫共沉淀實驗
        4.2.1 pAcGFP1‐Bait 和 pProlabel‐Prey 質粒的構建
        4.2.2 AcGFP1‐Bait 和 ProLabel‐Prey 共轉染 293FT 細胞
        4.2.3 化學發(fā)光免疫共沉淀實驗
    4.3 ORF2 蛋白與肝細胞相互作用蛋白的生物信息學分析
五 實驗結果
    5.1 酵母雙雜交篩選實驗結果
        5.1.1 酵母雙雜交誘餌質粒大量提取后鑒定及定量
        5.1.2 酵母報告株 NMY51 轉化誘餌質粒后菌落 PCR 鑒定
        5.1.3 誘餌質粒功能性驗證
        5.1.4 酵母雙雜交文庫篩選壓力選擇
        5.1.5 酵母雙雜交篩選與 HEV ORF2 相互作用的豬肝細胞文庫
        5.1.6 捕獲蛋白亞細胞定位
    5.2 化學發(fā)光免疫共沉淀
        5.2.1 化學發(fā)光免疫共沉淀質粒的構建
        5.2.2 化學發(fā)光免疫共沉淀質粒表達鑒定
        5.2.3 化學發(fā)光免疫共沉淀結果
        5.2.4 相互作用蛋白功能富集聚類分析
        5.2.5 捕獲蛋白與基因 1 型、4 型 HEV ORF2 結合力的比較
討論
小結
參考文獻
論文綜述
    參考文獻
致謝



本文編號：2932405