目的觀(guān)察脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/CD36在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚中的作用,并探討其分子機(jī)制。方法 HepG2細(xì)胞分對(duì)照組和棕櫚酸組,用Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因、熒光定量PCR、多聚核糖體分析檢測(cè)棕櫚酸對(duì)CD36表達(dá)、啟動(dòng)子活性和蛋白翻譯效率的影響;油紅O染色和FFA定量測(cè)定反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量;熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀(guān)察細(xì)胞對(duì)FFA的動(dòng)態(tài)攝入。然后將小干擾RNA轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞,構(gòu)建低表達(dá)CD36的HepG2細(xì)胞和陰性對(duì)照HepG2。用油紅O染色,FFA定量和熒光顯微鏡觀(guān)測(cè)棕櫚酸負(fù)荷的轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和FFA攝取。結(jié)果棕櫚酸能促進(jìn)HepG2細(xì)胞CD36的表達(dá),增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性,增加蛋白翻譯效率;棕櫚酸組細(xì)胞內(nèi)脂滴增多,FFA含量(240.17±19.83)ng/mg明顯高于對(duì)照組(144.60±53.52)ng/mg(P<0.05),脂肪酸攝取速度也明顯快于對(duì)照組;低表達(dá)CD36的HepG2細(xì)胞中CD36的mRNA和蛋白含量?jī)H為陰性對(duì)照細(xì)胞的58%和50%。低表達(dá)CD36的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯少于陰性對(duì)照,FFA水平(98.38±14.18)ng/m... 

【文章來(lái)源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2015年13期 第1308-1313頁(yè) 北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

Westernblot檢測(cè)棕櫚酸對(duì)HepG2細(xì)胞CD36蛋白

高密度圖2CD36啟動(dòng)子載體的構(gòu)建及棕櫚酸對(duì)CD36翻譯效率的影響2．3棕櫚酸對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響普通HepG2細(xì)胞用0、0．16mmol/L棕櫚酸處理24h后，正置顯微鏡觀(guān)察油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組(Control)相比，棕櫚酸組(PA)的HepG2細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴增加;同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)FFA含量發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組(240．17±19．83)ng/mg較對(duì)照組(144．60±53．52)ng/mg明顯升高(P＜0．05，n=4)，結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致(圖3A)。在顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組的細(xì)胞對(duì)FL-C16的攝取速率較對(duì)照組加快(圖3B)。A:HepG2細(xì)胞油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)FFA定量(×400);B:HepG2細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記FFA的動(dòng)態(tài)攝取攝像(×200)圖3棕櫚酸對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響2．4抑制CD36表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞CD36表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響我們將CD36-siＲNA和NC-siＲNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞成功構(gòu)建了低表達(dá)CD36的HepG2細(xì)胞(CD36-siＲNA-HepG2，CD36ＲNAi)和陰性對(duì)照HepG2(NC-siＲNA-HepG2，NC)。CD36ＲNAi的HepG2中CD36mＲNA與蛋白分別為NC組的(0．58±0．08)(P＜0．05，n=6)，(0．50±0．10)(P＜0．05，n=3)。給予CD36ＲNAi和NC組細(xì)胞0．16mmol/L棕櫚酸處理24小時(shí)后，油紅O染色(圖4A)發(fā)現(xiàn)CD36ＲNAi組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯少于NC組，與細(xì)胞內(nèi)FFA定量測(cè)定結(jié)果相符［NC組(240．17±21．12)ng/mg，CD36ＲNAi組(98．38±14．18)ng/mg，P＜0．05，n=4］，顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀(guān)察也證實(shí)CD36ＲNAi組細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細(xì)胞(圖4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)JThirdMilMedUnivVol．37，No．13Jul．152015

A:ＲNA干擾后HepG2細(xì)胞的CD36蛋白表達(dá);B:ＲNA干擾后HepG2細(xì)胞的油紅O染色(×400);C:ＲNA干擾后HepG2細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記FFA的動(dòng)態(tài)攝取攝像(×200)圖4抑制CD36表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響3討論NAFLD是一組無(wú)過(guò)量飲酒史，又除外其他肝病的以肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)過(guò)度堆積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌［10－11］。幾乎所有NAFLD患者的血清游離脂肪酸含量較正常人群有不同程度的升高［12］，而且NAFLD患者肝內(nèi)的脂質(zhì)約有60%都來(lái)源于外周，因此血循環(huán)中的脂肪酸異常轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)，是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)異常積聚的重要原因［13］。CD36是具有多種功能的膜蛋白，如介導(dǎo)長(zhǎng)鏈脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，黏附多種生物大分子并通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)引發(fā)相應(yīng)的炎癥、噬菌、內(nèi)吞功能等［14］。既往研究提示CD36與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):NAFLD患者的肝臟CD36表達(dá)增加，且CD36的表達(dá)量與肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)［15］;而改善小鼠的肝內(nèi)脂質(zhì)積聚后，其肝臟的CD36表達(dá)也相應(yīng)地降低［16］。但是，CD36參與NAFLD發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。本研究表明棕櫚酸可以明顯上調(diào)HepG2細(xì)胞中CD36蛋白的表達(dá)。蛋白的表達(dá)受到多因素的復(fù)雜調(diào)控，其中，基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。因此，我們首先構(gòu)建了人CD36啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，測(cè)定CD36啟動(dòng)子活性，同時(shí)應(yīng)用熒光定量PCＲ測(cè)定細(xì)胞CD36的mＲNA表達(dá)。結(jié)果表明:棕櫚酸對(duì)CD36的轉(zhuǎn)錄有明顯促進(jìn)作用。進(jìn)一步，我們應(yīng)用多聚核糖體分析觀(guān)察了棕櫚酸對(duì)CD36蛋白翻譯的影響。核糖體是生物體蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mＲNA與核糖體結(jié)合后啟動(dòng)蛋白翻譯，與寡核糖體結(jié)合

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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