發(fā)布時間：2020-11-21 11:43

　　 鎘(Cadmium,Cd)是一種對人體健康威脅巨大的有毒重金屬。急性高劑量的Cd暴露可導致肝、腎等多個臟器的損傷,慢性低劑量的Cd脅迫又與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。Cd的生物半衰期長達10-30年,經消化道吸收的Cd通過門靜脈首先到達肝臟并蓄積于此,因此,肝臟是Cd毒性重要的靶器官之一。在痛痛病患者中肝纖維化發(fā)生率顯著增高,肝纖維化可能是肝臟高Cd蓄積引起的特異性病理變化。流行病學顯示,慢性肝病的進展可能與Cd暴露有關。在動物實驗中,長時間Cd暴露可導致肝間質纖維化。然而,Cd暴露在肝纖維化發(fā)生、進展中的作用機理尚不清楚。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)與肝纖維化發(fā)生及進展有關。肝損傷時,靜息狀態(tài)的HSC被激活轉化為肌成纖維細胞并產生αSMA和Ⅰ型膠原纖維參與肝纖維化的發(fā)生,而HSC活化狀態(tài)的維持又與肝纖維化的進展有關。因此,本研究擬從Cd暴露影響HSC的活化及其可能的氧化應激機制著手,以闡釋Cd暴露在肝纖維化發(fā)生、進展的作用,為進一步理解Cd暴露的肝臟遠期效應提供證據(jù)。方法:(1)Cd染毒的動物實驗,分為4組:空白對照組、GSH對照組、Cd干預組及Cd+GSH干預組。利用生化分析儀檢測肝功能指標,HE染色檢測肝臟病理改變,Masson染色檢測肝組織中膠原分布,免疫組化檢測肝組織中αSMA的表達。透射電鏡下觀察肝細胞及HSC超微結構的變化,分光光度儀或酶標儀檢測肝組織中GSH,Vc,SOD,CAT和GSH-Px的水平,Western Blot檢測HSC活化標志物,NF-κB及MAPK信號通路中相關蛋白的變化。(2)HSC的體外激活,利用Cd干預L02的條件培養(yǎng)基(CM)干預LX-2細胞,分3組:(L02-CM),(Cd-L02-CM)和(Cd+GSH-L02-CM),檢測LX-2中αSMA的表達。(3)利用質譜流式對不同濃度Cd干預的LX-2細胞進行Cd信號及活力的檢測。多次低劑量Cd干預(0.5μM,2μM)對HSC-T6細胞表型及功能的影響,流式細胞術檢測細胞凋亡,ROS水平,CCK8實驗檢測細胞活力,劃痕及Transwell實驗檢測遷移能力,油紅O染色檢測細胞內脂滴分布,熒光顯微鏡檢測ROS水平,Western Blot檢測HSC活化標記物及Nrf-2和NF-κB信號通路中相關蛋白的表達。結果:1.Cd暴露誘導肝細胞氧化損傷,激活HSC。(1)Cd暴露與肝損傷。Cd干預組可使血清AST,GGT及XOD較對照組顯著升高(P0.05),給予GSH可降低上述肝損傷指標(P0.05);肝組織HE染色顯示,Cd干預組出現(xiàn)炎細胞浸潤、肝細胞壞死等病理改變;透射電鏡下見Cd干預組細胞線粒體雙層膜及內部嵴結構破壞。(2)Cd暴露與HSC激活。Cd干預組肝組織中αSMA蛋白表達量增加,αSMA陽性細胞在脈管周圍區(qū)域有較多分布。透射電鏡下見Cd干預組HSC內部脂滴消失且周圍有膠原纖維。而Cd+GSH組較Cd干預組αSMA蛋白表達量下降(P0.05),αSMA陽性細胞主要分布在血管壁,電鏡下HSC內富含脂滴,呈靜息狀態(tài)。(3)Cd暴露與體內氧化還原狀態(tài)的改變。Cd干預組肝臟中小分子抗氧化物GSH及Vc含量升高,但SOD,CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性降低,而Cd+GSH干預組,小分子抗氧化物GSH和Vc升高(P0.05),抗氧化酶SOD,CAT的活性較對照組無明顯變化,GSH-Px活性升高(P0.05)。(4)Cd暴露與NF-κB和MAPK信號通路內相關蛋白表達的改變。Cd干預組增加p-P65,p-IKBα及p-JNK蛋白的表達(P0.05);Cd+GSH干預組,上調p-P65蛋白,但p-JNK的表達量較對照組無明顯變化(P0.05)。(5)HSC的體外激活。GSH干預可降低L02細胞中Cd含量及ROS的生成,Cd-L02-CM干預后的LX-2細胞αSMA表達增加。2.Cd干預對肝星狀細胞表型及功能的影響。(1)LX-2細胞Cd攝取及活力。利用不同濃度Cd干預LX-2 1h后,5μM Cd干預組~(114)Cd陽性細胞比例為98.88%;其~(114)Cd中位信號強度為77.15,高于其他組;對照組、0.5μM和5μM CdCl_2干預組~(195)pt強陽性細胞(代表細胞活力差)的比例分別為11.32%,15.46%和35.5%。CCK8檢測發(fā)現(xiàn)5μM Cd干預可抑制LX-2細胞增殖。(2)多次低劑量Cd干預后,對HSC-T6細胞功能及表型的影響。對照組、0.5μM和2μM CdCl_2干預組HSC-T6細胞凋亡率未見差異;多次0.5μM Cd干預后,HSC-T6增殖、遷移能力增強。油紅O染色可見對照組細胞內脂滴較多見,而Cd干預組脂滴較少。同樣的,Cd干預后纖維化相關蛋白αSMA表達量增加,多次Cd干預后的HSC-T6再次Cd干預時Cd攝取能力降低,其p-P65,HO-1蛋白表達量也較對照組增加。(3)低劑量Cd干預后對高劑量Cd暴露的影響。2μM+30μM Cd干預組可在一定程度上對抗高Cd毒性,其細胞活力高于其他組。2μM+30μM Cd干預組ROS生成較少,而0+30μM及0.5+30μM Cd干預組可見ROS強陽性峰。結論:(1)Cd可能通過降低抗氧化酶活性,上調p-JNK蛋白,促進ROS生成,誘導肝細胞氧化損傷,激活HSC。而外源性給予GSH,可減少細胞內Cd攝取,一定程度恢復抗氧化酶活性,并可能通過上調p-P65,抑制p-JNK蛋白表達,減輕氧化損傷,減少HSC激活。(2)Cd可影響活化HSC的功能及表型。多次低劑量的Cd干預HSC后,HSC活化相關標志物表達增加,細胞增殖、遷移能力增強。其活化狀態(tài)及拮抗高Cd毒性能力的改變可能與上調HO-1,p-P65等蛋白表達有關。(3)質譜流式技術可作為一種研究Cd單細胞毒理的新工具。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1-2 人體內 Cd 的吸收、代謝、儲存及排泄[23].1-2 The process of absorption, metabolism, storage and excretion of Cd in human body在動物試驗中，急性 Cd 暴露可導致肝損傷，病理表現(xiàn)為局灶性肝細胞壞核固縮，炎細胞浸潤并有血清 ALT 和 AST 升高[24-26]。單次高劑量 C鼠 6 h 后，肝臟的超微結構主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，粗面內質網嚴重擴化并伴核糖體減少[27]。Cd 致急性肝損傷的機制可分為直接損傷和繼直接損傷主要包括氧化應激，含巰基基團抗氧化物的失活，線粒體損傷發(fā)損傷通常由 Kupffer 細胞的激活并導致炎癥反應的發(fā)生[28]。長時間的，可誘發(fā) NFS 小鼠產生肝臟腫瘤[29]。此外，在乙型病毒性肝炎表面抗轉基因小鼠中，同時給予 Cd 暴露，可使腫瘤分化更差[29]。細胞死亡表型轉化是細胞對持續(xù)性 Cd 刺激響應的兩種常見結局[30]。體外試驗濃度的 Cd 可以誘導不同種屬來源的肝細胞發(fā)生自噬，凋亡，焦亡等不死亡[31-33]。長時間低劑量 Cd 干預(1 μM，28 周)使大鼠肝臟 TRL121

圖 1-3 HSC 的活化的途徑[149]，HSC 的活化可分為起始刺激和活化維持。Fig.1-3 Pathways of hepatic stellate cell activation[149], Features of stellate cell activation canbe distinguished between those that stimulate initiation and those that contribute to perpetuation.1.2.7 金屬蓄積與肝纖維化病毒性肝炎，酒精性肝病是肝纖維化的常見病因，這些肝病以炎性細胞不斷浸潤，膠原持續(xù)堆積為特征。有研究表明氧化應激可以參與調節(jié)膠原的生成及纖維化的形成。而金屬離子（Cu2+，F(xiàn)e2+等）作為天然的自由基反應的催化劑具有調控肝纖維化的潛質[150]。此外，許多研究表明在肝硬化患者中存在金屬元素代謝的紊亂，表現(xiàn)為檢測的生物樣本中出現(xiàn)必需元素的減少和毒性重金屬的增加，而這種紊亂可能是肝病發(fā)展的一個重要原因[42, 43]。鐵（ferrum, Fe）是人體必需的微量元素，其作為多種分子的組分參與機體代謝反應。體內的非血基質Fe可嵌入酶的Fe-S中心，調節(jié)基因編碼酶的生成并參與細胞的增殖和分化[151]。肝臟是Fe貯藏及鐵調蛋白合成的主要器官。研究表明肝纖維化及肝硬化進展的過程與肝細胞內Fe超載關系密切。機體中銅、Fe含量

蘭州大學博士研究生學位論文 鎘暴露影響肝星狀細胞活化及其氧化應激機制研究 為肝纖維化的主要效應細胞，在肝纖維化發(fā)生及進展中起重要作用，HSC 的激活可促肝纖維化發(fā)生，而其持續(xù)活化狀態(tài)又與肝纖維化進展密切相關。綜上，本研究擬從 Cd 暴露影響 HSC 的激活與活化狀態(tài)及其可能的氧化應激機制著手，闡釋 Cd 暴露在影響肝纖維化進程中的作用。主要包括兩部分：一、通過體內及體外實驗研究 Cd 暴露誘導肝細胞氧化損傷對 HSC 激活的影響；二、通過低劑量 Cd 對部分活化的肝星狀細胞株進行干預，探討低劑量 Cd 暴露后對活化 HSC 功能及表型的影響，此外，本部分還將利用質譜流式細胞技術探討其在單細胞內 Cd 含量測定及細胞活力的運用，從單細胞層面全新視角揭示 Cd 的毒性效應，為 Cd 毒性機理研究提供一種新的研究策略。本研究通過探討 Cd 暴露如何影響 HSC 的活化及可能的氧化應激，為進一步深入理解 Cd 暴露的肝臟遠期效應提供實驗的依據(jù)。技術路線見下圖 1-4／1-5。
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本文編號：2892947