第一章SD大鼠胰島素抵抗非酒精性脂肪肝病模型的構(gòu)建 目的:構(gòu)建SD大鼠胰島素抵抗(IR)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動物模型。 方法:雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組各16只。正常飲食組喂養(yǎng)普通飼料(脂肪占攝入能量的19%),高脂飲食組喂養(yǎng)高脂飼料(脂肪占攝入能量的45%),喂養(yǎng)8周。8周末使用正常血糖—高胰島素鉗夾技術(shù)穩(wěn)態(tài)時的葡萄糖輸注率(GIR)來評價胰島素敏感性;抽取門靜脈血測定空腹血糖(FBS)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST);游離肝臟稱肝濕重,計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重(g)/體重(g)×100%);光鏡下HE染色和蘇丹三染色對肝臟的脂肪變性情況進(jìn)行評定。 結(jié)果:肝組織病理學(xué)檢查顯示,高脂飲食組大鼠肝細(xì)胞均呈現(xiàn)彌漫性大泡性脂肪變性,發(fā)展為NAFLD,正常飲食組肝臟無異常;與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠肝指數(shù)、GIR、FIRI、血清ALT、AST、胰島素、TG、TC均明顯增高,比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。 結(jié)論:SD大鼠持續(xù)8周高脂飲食喂養(yǎng)成功構(gòu)建了IR NAFLD動物模型。該模型的代謝特征為IR、高胰島素血癥、高脂血癥及血清轉(zhuǎn)氨酶升高 第二章高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠胰島素抵抗非酒精性脂肪肝病機(jī)制的初步探討 目的:探討SD大鼠高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的分子機(jī)制:肝臟c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)蛋白表達(dá)及胰島素受體底物-1絲氨酸307(IRS-1 Ser~(307))磷酸化水平的變化,闡明JNK1蛋白在NAFLD形成中對IR的作用的分子機(jī)制;氧化應(yīng)激及脂肪因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)改變在IR NAFLD形成中的作用。 方法:SD大鼠隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組,喂養(yǎng)8周后處死動物留取標(biāo)本,檢測肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)、游離脂肪酸(FFAs)及TNF-α的變化,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測JNK1蛋白在肝組織中的表達(dá),應(yīng)用Western blot檢測JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平。 結(jié)果:與正常飲食組大鼠相比,高脂飲食組大鼠的肝組織勻漿MDA、FFAs、TNF-α明顯增高,SOD明顯降低,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。JNK1蛋白免疫組織化學(xué)顯示:與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠肝組織JNK1抗體陽性細(xì)胞胞漿染色棕褐色,正常飲食組大鼠肝組織無明顯JNK1抗體陽性細(xì)胞,高脂飲食組大鼠肝組織JNK1抗體陽性細(xì)胞約10%。高脂飲食組JNK1蛋白表達(dá)增高,并與IR呈正相關(guān),IRS-1 Ser~(307)的磷酸化水平較正常飲食組明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。 結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠IR NAFLD的部分分子機(jī)制可能為:JNK1在肝臟表達(dá)增高,并通過上調(diào)IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平,干擾了胰島素與胰島素受體結(jié)合后的信號傳導(dǎo),最終減弱胰島素的生理作用,導(dǎo)致IR;TNF-α及氧應(yīng)激-脂質(zhì)過氧化損傷是高脂飲食誘導(dǎo)IRNAFLD的機(jī)制之一。 第三章應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建WT-JNK1重組腺病毒 目的:制備表達(dá)野生型c-Jun氨基末端激酶1(WT-JNK1)復(fù)制缺陷型重組腺病毒。 方法:將重組穿梭載體pAdTrack-CMV-WT-JNK1線性化后,與pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,進(jìn)行同源重組得到重組腺病毒載體。將重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞HEK293內(nèi)制備復(fù)制缺陷型重組腺病毒,并經(jīng)PCR及DNA測序鑒定,擴(kuò)增收集重組腺病毒,測定病毒滴度。 結(jié)果:JNK1重組腺病毒載體能有效轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)成功包裝,搜集的病毒經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到特定JNK1基因片段并測序鑒定正確,并擴(kuò)增出2.5×10~(10)pfu/ml的高滴度重組腺病毒。 結(jié)論:該研究成功構(gòu)建了JNK1重組腺病毒,為進(jìn)一步研究JNK1的作用及應(yīng)用JNK1進(jìn)行相關(guān)疾病的基因防治研究奠定了基礎(chǔ)。 第四章應(yīng)用腺病毒載體過表達(dá)WT-JNK1對NAFLD的影響及機(jī)理 目的:應(yīng)用腺病毒載體過表達(dá)野生型c-Jun氨基末端激酶1(WT-JNK1)基因,研究其對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的形成過程的影響,進(jìn)一步探討JNK1在胰島素抵抗(IR)NAFLD發(fā)病中的作用。 方法:SD大鼠隨機(jī)分為高脂對照組、Ad-GFP組、表達(dá)WT-JNK1的腺病毒(Ad-WT-JNK1)組。均用高脂飼料喂養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)第一周,高脂對照組尾靜脈注入生理鹽水,Ad-GFP組尾靜脈注入2×10~(10)pfu的Ad-GFP,Ad-WT-JNK1組尾靜脈注入2×10~(10)pfu的Ad-WT-JNK1,8周末進(jìn)行正常血糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)檢測IR;抽取門靜脈血留取標(biāo)本,檢測空腹血糖(FBS)、空腹胰島素(FINS)、甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、游離脂肪酸(FFAs)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等指標(biāo);觀察肝組織脂肪變性;應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測JNK1蛋白在肝組織中的表達(dá),應(yīng)用Western blot檢測JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平。 結(jié)果:與高脂對照組和Ad-GFP組相比較,Ad-WT-JNK1組大鼠肝組織脂肪變性明顯加重,并出現(xiàn)炎癥性改變,TG、TC、ALT、AST明顯增高,高胰島素血癥進(jìn)一步加重,IR水平更加嚴(yán)重;MDA及TNF-α水平明顯增高,SOD水平明顯降低;JNK1蛋白表達(dá)及IRS-1Ser~(307)磷酸化水平明顯增高,比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P＜0.05)。與高脂對照組相比,Ad-GFP組大鼠動物的體重、肝指數(shù)、生化學(xué)指標(biāo)、GIR、肝組織脂肪變性情況、JNK1蛋白表達(dá)及IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平均無明顯差異。動物注射腺病毒后,均未出現(xiàn)皮膚過敏等反應(yīng)異常,動物死亡等現(xiàn)象。 結(jié)論:WT-JNK1重組腺病毒基因轉(zhuǎn)染SD大鼠后,能明顯上調(diào)JNK1蛋白的表達(dá),通過作用于IRS-1 Ser~(307)磷酸化導(dǎo)致IR,加重了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展,腺病毒能夠安全應(yīng)用于SD大鼠IR NAFLD發(fā)病機(jī)制的研究。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

病理學(xué)變化NG大鼠肝臟呈暗紅色，無異常變化;FG大鼠肝臟體包膜緊張，邊緣圓鈍，肝臟呈奶黃色，切面油膩。光鏡片，NG肝索結(jié)構(gòu)正常，無肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸周末時出現(xiàn)以大泡性為主的脂肪變性，HE染色顯示胞漿邊，偶可見小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，蘇丹三染色見肝細(xì)胞小葉內(nèi)脂肪變性的肝細(xì)胞所占比例為40.2社3.62(%)，未出現(xiàn)肝纖維化。見圖1一3至圖1一8。

核居邊，偶可見小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，蘇丹三染色見肝細(xì)胞內(nèi)有大量橘紅色脂滴，肝小葉內(nèi)脂肪變性的肝細(xì)胞所占比例為40.2社3.62(%)，達(dá)到了脂肪肝的標(biāo)準(zhǔn);未出現(xiàn)肝纖維化。見圖1一3至圖1一8。圖1一 3NG大鼠肉眼觀圖1一 4FG大鼠肉眼觀

NG、FG大鼠FBS、FINS的變化
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本文編號：2854854