B淋巴細(xì)胞是骨髓干細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞,它依靠向血液和粘膜組織分泌抗體介導(dǎo)體液免疫,同時(shí)它也可以作為抗原提呈細(xì)胞向T細(xì)胞提供抗原和刺激信號(hào),并激活T細(xì)胞使其發(fā)揮免疫效應(yīng)。近年來,根據(jù)大量的文獻(xiàn)報(bào)道,B細(xì)胞還具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,在多種自身免疫病和炎癥中發(fā)揮著緩解疾病的作用；另一方面,B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用對(duì)于抗腫瘤免疫治療的干擾也成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是,B細(xì)胞在疾病中負(fù)性調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制,還存在著巨大的爭(zhēng)議。因此,在疾病中研究B細(xì)胞發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的具體方式有著重要的意義。 1996年,Wolf等人發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型(WT)小鼠,用B細(xì)胞缺陷的μMT小鼠建立的實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎模型(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)出現(xiàn)了疾病極度惡化的狀況,這為B細(xì)胞在疾病中具有緩解作用提供了有力證據(jù)。自此,B細(xì)胞緩解疾病的負(fù)性調(diào)節(jié)作用成為了免疫學(xué)家研究的熱點(diǎn),在多種動(dòng)物模型和人類疾病中大量研究。目前,普遍接受的B細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的方式大致分為兩種：1.在炎癥和腫瘤疾病中,B細(xì)胞通過分泌IL-10等調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子或者依靠分泌抗體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。2.B細(xì)胞通過同其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)相互協(xié)同發(fā)揮作用。但是,目前對(duì)于B細(xì)胞在炎癥性腸病中調(diào)節(jié)作用的機(jī)制知之甚少。 炎癥性腸病(Inflammation Bowel Disease,IBD)是一組以腸道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腸粘膜受損為主要表現(xiàn)的腸道慢性炎癥病變,它包含克羅恩氏病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)兩種疾病,全世界每年有10,000-50,000的新增病例。炎癥性腸病病人可以表現(xiàn)出不可預(yù)測(cè)性腸道綜合征,此外,腸炎病癥還有發(fā)展成為腸癌的可能,因而對(duì)于炎癥性腸病的研究愈來愈受到重視。腸道免疫系統(tǒng)對(duì)于腸道病原菌的過激反應(yīng)被認(rèn)為是炎癥性腸病產(chǎn)生的原因之一,已有研究表明,在腸炎局部,巨噬細(xì)胞以及粒細(xì)胞等在腸道中大量浸潤(rùn)并且分泌IL-17,IL-6,TNF-α等細(xì)胞因子。而另一方面,在腸道免疫耐受系統(tǒng)中,存在著阻止病原菌接觸腸道免疫系統(tǒng)并抑制過激性反應(yīng)的免疫細(xì)胞和分子。文獻(xiàn)報(bào)道,Treg和B細(xì)胞分泌的IgA大量存在于腸組織中,對(duì)于維持腸穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,目前已有研究表明,Treg和B細(xì)胞的缺失會(huì)影響腸道疾病的轉(zhuǎn)歸。然而,對(duì)于這些緩解疾病的調(diào)節(jié)因素之間的關(guān)系以及它們促使疾病轉(zhuǎn)歸的具體方式尚未有系統(tǒng)性研究。 在此,我們以葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium, DSS)誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型作為研究對(duì)象,就B細(xì)胞在炎癥性腸病中的作用以及其與Treg在腸相關(guān)免疫系統(tǒng)中的相互關(guān)系展開了研究。這些問題的闡明將有助于“B細(xì)胞在腸炎中的調(diào)節(jié)作用”這一新領(lǐng)域的研究拓展,并為臨床腸炎的干預(yù)和治療提供了新視野。 第一部分B細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病的癥狀 如前所述,IBD分為兩種疾病類型,潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病。DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥是模擬人類潰瘍性結(jié)腸炎的一種動(dòng)物模型,廣為認(rèn)可。其病程可分為開始階段即第0-3天,表現(xiàn)為粒細(xì)胞浸潤(rùn),固有免疫系統(tǒng)開始激活；急性期即第4-9天,表現(xiàn)為粘膜損傷,腸道吸收停止,體重下降；以及疾病緩解期即10天以后,腸粘膜浸潤(rùn)的粒細(xì)胞開始減少,腸炎癥狀消退。DSS誘導(dǎo)的腸炎局限在大腸內(nèi),其疾病的主要癥狀為小鼠的大便性狀改變,便中帶血和體重減輕等,病理表現(xiàn)為全結(jié)腸粘膜層和粘膜下層的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和糜爛,杯狀細(xì)胞缺失和粘膜固有層增厚。 據(jù)此,我們首先給予8-12周齡的小鼠2%的DSS,建立腸炎模型。然后在不同的時(shí)間點(diǎn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)脾臟和腸相關(guān)免疫組織(Gut associated lymphoid tissue,GALT)中免疫細(xì)胞格局的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：急性炎癥期外周免疫器官和腸相關(guān)免疫器官中B細(xì)胞的數(shù)量和比例變化明顯,甚至在炎癥開始的階段B細(xì)胞的數(shù)量已有增高趨勢(shì),提示B細(xì)胞可能參與腸炎的疾病進(jìn)程。 為進(jìn)一步研究B細(xì)胞顯著性變化在炎癥性腸病中的意義。我們以上述模型為基礎(chǔ),利用基因敲除小鼠——μMT小鼠與體內(nèi)中和抗體——抗CD20單克隆抗體,在B細(xì)胞缺陷的情況下誘導(dǎo)腸炎。通過稱量小鼠體重,觀察小鼠大便性狀和病理切片,我們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：和野生型(wild type,WT)小鼠相比,用B細(xì)胞缺陷的小鼠誘導(dǎo)的炎癥性腸病,其癥狀更加嚴(yán)重,死亡率增高且?guī)缀鯚o緩解跡象。而向B細(xì)胞缺陷的小鼠體內(nèi)過繼性轉(zhuǎn)輸野生型小鼠B細(xì)胞之后再誘導(dǎo)疾病發(fā)生,病癥有所減輕,并接近于野生型小鼠的癥狀和病理表現(xiàn)。 這些結(jié)果表明,B細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病中,起到緩解疾病的作用。 第二部分Treg等參與B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腸病的調(diào)節(jié) 目前的研究顯示,IL-10依賴的方式是B細(xì)胞發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的主要方式之一,在EAE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)模型等自身免疫性疾病中,均有研究證實(shí)其緩解疾病的方式主要依靠分泌IL-10。 因此,為了進(jìn)一步探討B(tài)細(xì)胞在本模型中負(fù)性調(diào)節(jié)的方式,我們檢測(cè)了外周免疫器官脾臟和腸相關(guān)免疫器官(GALT)一一腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes, MLN),派氏結(jié)(peyer's patch, PP),腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocyte,iEL),腸固有層淋巴細(xì)胞(Lamina propria lymphocyte,LPL)中B細(xì)胞IL-10的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在腸炎階段,IL-10分泌性B細(xì)胞的水平并沒有增高。提示IL-10可能并未參與B細(xì)胞對(duì)炎癥性腸病的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 為證實(shí)這一觀點(diǎn),我們同時(shí)向μMT小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)輸了分別來自野生型小鼠和IL-10缺陷小鼠的B細(xì)胞,然后用DSS誘導(dǎo)炎癥性腸病,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于未轉(zhuǎn)輸組,轉(zhuǎn)輸了IL-10缺陷小鼠來源的B細(xì)胞和轉(zhuǎn)輸了野生型小鼠B細(xì)胞同樣可以緩解疾病的進(jìn)程和癥狀。這進(jìn)一步說明,在DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病中,B細(xì)胞緩解疾病方式不是IL-10依賴性的。 近兩年,關(guān)于B細(xì)胞非IL-10依賴性負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制也有大量的研究,其中,受到廣泛認(rèn)可的是B細(xì)胞依靠與其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞相互促進(jìn)的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此,B細(xì)胞和在腸道免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Tregs)的關(guān)系成為了我們探索的目標(biāo)。我們利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)了炎癥期小鼠各臟器的Treg的表達(dá),結(jié)果Tregs在疾病過程中數(shù)量有所增高,這提示了Treg可能影響了疾病的進(jìn)程。更為重要的是,Treg變化和B細(xì)胞的變化呈正相關(guān),因此,Treg可能參與了B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腸病的抑制. 為了進(jìn)一步證實(shí)這一觀點(diǎn),我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了μMT小鼠各器官Treg的比例和數(shù)量,以及轉(zhuǎn)輸了B細(xì)胞后Treg數(shù)量的變化。結(jié)果顯示,無論在健康還是腸炎的情況下,Treg的數(shù)量在IμMT小鼠大部分腸相關(guān)免疫細(xì)胞中均下降,而回輸B細(xì)胞后,Treg數(shù)量回升,接近野生型小鼠的水平。 這部分結(jié)果表明,B細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中的調(diào)節(jié)作用和Treg有關(guān),而與IL-10的分泌無關(guān)。 第三部分B細(xì)胞與Treg在炎癥微環(huán)境中的相互作用及機(jī)制 為了進(jìn)一步明確B細(xì)胞維持Treg數(shù)量的機(jī)制,我們檢測(cè)了Treg的增殖和向腸局部遷移的水平。結(jié)果顯示Treg的增殖水平在μMT小鼠中減少,而在B細(xì)胞回輸?shù)膶?shí)驗(yàn)組中增高,提示B細(xì)胞在體內(nèi)有促進(jìn)Treg增殖的作用。因此我們假設(shè),在腸炎中B細(xì)胞通過促進(jìn)Treg的增殖維持了Treg數(shù)量,從而使得Treg可以更好的緩解腸炎癥狀。 為了證實(shí)這一點(diǎn),我們以T,B細(xì)胞缺陷小鼠Rag基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,向其過繼性轉(zhuǎn)輸淋巴細(xì)胞,并建立DSS誘導(dǎo)的炎癥模型。結(jié)果顯示,所有未轉(zhuǎn)輸B細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組疾病狀況嚴(yán)重,即使轉(zhuǎn)輸了Treg,癥狀也無法完全緩解；而共同轉(zhuǎn)輸了B細(xì)胞和Treg的實(shí)驗(yàn)組疾病癥狀較輕,且疾病后期有轉(zhuǎn)歸跡象。令人驚訝的是,未轉(zhuǎn)輸Treg而僅轉(zhuǎn)輸了B細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組疾病狀況也較輕,因此,我們?cè)诩膊“l(fā)生的急性期,用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析了這組小鼠體內(nèi)細(xì)胞的表達(dá),結(jié)果顯示,B細(xì)胞在腸炎微環(huán)境中有誘導(dǎo)幼稚型CD4+Foxp3-T細(xì)胞向CD4+Foxp3+Treg方向轉(zhuǎn)化的作用。 大量文獻(xiàn)表明,誘導(dǎo)型Treg (induced Treg, iTreg)和自然型Treg (nature Treg, iTreg)的表型和作用沒有明顯的區(qū)別。按照我們的假說,如果疾病最終由Treg緩解,那么我們只要轉(zhuǎn)輸大量的Treg就可以在B不存在的情況下緩解疾病。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大量轉(zhuǎn)輸Treg仍無法緩解疾病,說明Treg不是疾病的最終緩解因素。但是,Treg缺陷的情況下B細(xì)胞也不能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,這說明Treg和B細(xì)胞之間還存在著一種被我們忽視的關(guān)系。 如前所述,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,腸粘膜的穩(wěn)態(tài)由Treg和粘膜中的IgA等共同維持,因此我們檢測(cè)了腸局部抗體的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在疾病發(fā)生時(shí)IgA這一腸粘膜保護(hù)性免疫球蛋白有規(guī)律的增高,而IgM, IgG等免疫球蛋白的變化并不明顯或無規(guī)律。更為重要的是,缺失Treg會(huì)使B細(xì)胞IgA的分泌顯著的減少,疾病加重。 綜上,我們認(rèn)為,在DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥緩解中,B細(xì)胞首先誘導(dǎo)了幼稚型T細(xì)胞向Treg的極化,并促進(jìn)了Treg增殖,從而維持了GALT中Treg的數(shù)量。其次,Treg正反饋性促進(jìn)B細(xì)胞分泌大量的IgA,中和清除腸細(xì)菌,阻止了過度激活的免疫反應(yīng)的發(fā)生,從而維持了腸穩(wěn)態(tài),對(duì)疾病起到了緩解作用。在本研究中,我們首次利用“MT小鼠建立了DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病,并首次將Treg的作用與B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以及其粘膜免疫功能的發(fā)揮結(jié)合在了一起。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R574
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 B細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病的癥狀
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第二部分 Treg參與B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腸病的抑制功能
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第三部分 B細(xì)胞與Treg在腸炎中的相互作用及機(jī)制
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人基本情況
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840454