研究目的阻塞性黃疸是一種由于各種原因?qū)е碌母蝺?nèi)外膽管阻塞,膽汁無法通過正常通道排出而淤積在體內(nèi)所致的一種臨床癥狀,常見于肝內(nèi)外腫瘤、胰頭腫瘤、結(jié)石嵌頓等疾病,肝功能在一定程度受到損害,機(jī)體發(fā)生復(fù)雜的病理生理改變。阻塞性黃疸存在特殊的痛覺現(xiàn)象,對(duì)傷害性刺激不敏感即痛閾增高。在臨床工作中痛閾增高容易導(dǎo)致患者就診延遲、圍術(shù)期麻醉鎮(zhèn)痛藥物使用相對(duì)過量、呼吸抑制、蘇醒延遲等,不利于病人術(shù)后恢復(fù)。本課題的目的是探索黃疸患者中樞增高的膽紅素(Bilirubin)通過與脊髓背角的5-羥色胺3A(5-hydroxytryptamine 3A,5-HT_(3A))受體結(jié)合激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神經(jīng)元,通過促進(jìn)抑制性遞質(zhì)GABA的合成釋放和增強(qiáng)GABA神經(jīng)元抑制性活動(dòng)介導(dǎo)阻塞性黃疸的痛閾增高。研究方法1、通過膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)創(chuàng)建阻塞性黃疸的模型,采用全自動(dòng)生化分析儀分析血清和腦脊液中肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的改變。BDL和膽紅素鞘內(nèi)注射測(cè)定Sprague-Dawley(SD)大鼠的痛閾。BDL、膽紅素鞘內(nèi)注射和脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng)后,通過western blot的方法觀察5-HT3受體各亞型的表達(dá)變化,并通過免疫熒光觀察BDL后脊髓切片神經(jīng)元激活情況和5-HT_(3A)受體表達(dá)變化。2、通過鞘內(nèi)注射5-HT_(3A)受體拮抗劑、GABAA受體拮抗劑、GABAB受體拮抗劑后測(cè)定BDL大鼠痛閾的變化。脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng)鑒定GABA能神經(jīng)元上5-HT_(3A)受體的表達(dá)情況,并進(jìn)一步通過western blot的方法觀察BDL、膽紅素鞘內(nèi)注射和脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng)膽紅素干預(yù)后GABA受體各亞型的表達(dá)變化,并通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)測(cè)定腦脊液內(nèi)GABA濃度。電生理技術(shù)記錄5-HT_(3A)受體激動(dòng)劑和膽紅素對(duì)脊髓背角GABA能抑制性突觸后電流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,s IPSC)的影響以及應(yīng)用5-HT_(3A)受體拮抗劑后電流變化。3、通過慢病毒將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入人胚腎293細(xì)胞(human embryonic kidney 293,HEK293)構(gòu)建過表達(dá)人5-HT_(3A)受體的HEK293細(xì)胞(HEK293-5-HT_(3A)),電生理膜片鉗觀察膽紅素和5-HT_(3A)受體激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)向電流的影響。放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定膽紅素和5-HT_(3A)受體的親和力大小,并通過同源建模和分子對(duì)接的方法模擬預(yù)測(cè)膽紅素和5-HT_(3A)受體的空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合方式以及結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果1、膽總管結(jié)扎術(shù)后大鼠血漿總膽紅素(total bilirubin,TB)、直接膽紅素(direct bilirubin,DB)和間接膽紅素(indirect bilirubin,IB)、膽汁酸(total bile acid,TBA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均隨著BDL時(shí)間增加而增加,而腦脊液中僅有TB和IB升高,且在3、5、7天顯著高于sham組。BDL后大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾顯著升高,鞘內(nèi)直接注射膽紅素后大鼠機(jī)械性痛閾和熱痛閾顯著高于注射前。BDL3d大鼠鞘內(nèi)注射昂丹司瓊抑制了膽總管結(jié)扎大鼠的痛閾升高,且具有濃度依賴性。BDL、膽紅素鞘內(nèi)注射以及膽紅素直接培養(yǎng)大鼠脊髓背角神經(jīng)元后5-HT_(3A)受體表達(dá)逐漸增加。免疫熒光顯示BDL后5-HT_(3A)受體表達(dá)高于假手術(shù)組,且活化的神經(jīng)元數(shù)量增加,活化的神經(jīng)元同時(shí)高表達(dá)5-HT_(3A)受體。2、鞘內(nèi)給予昂丹司瓊(ondansetron)、荷包牡丹堿(bicuculline)顯著降低黃疸大鼠的痛閾,而CGP55845對(duì)痛閾的降低作用較弱。且昂丹司瓊、荷包牡丹堿抑制了鞘內(nèi)注射5-HT_(3A)受體激動(dòng)劑m CPBG、膽紅素誘導(dǎo)的痛閾增高。脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng)免疫熒光染色顯示培養(yǎng)的GABA能中間神經(jīng)元多數(shù)表達(dá)5-HT_(3A)受體,且BDL、膽紅素鞘內(nèi)注射大鼠以及膽紅素直接培養(yǎng)脊髓背角神經(jīng)元后GABAA受體表達(dá)增加,昂丹司瓊在一定程度抑制GABAA受體的表達(dá)。ELISA提示BDL和膽紅素鞘內(nèi)注射后腦脊液內(nèi)GABA濃度明顯增加,昂丹司瓊干預(yù)后GABA水平有短暫下降。電生理記錄提示m CPBG、膽紅素增強(qiáng)GABA能神經(jīng)元的s IPSC,而昂丹司瓊干預(yù)后m CPBG、膽紅素對(duì)s IPSC的作用減弱。3、膽紅素誘發(fā)HEK293-5-HT_(3A)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流。放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)膽紅素同5-HT_(3A)受體有較弱的親和力,兩者以能量較低的方式相結(jié)合。膽紅素能夠進(jìn)入5-HT_(3A)受體亞基之間形成的疏水間隙,兩者在空間結(jié)構(gòu)上具有良好的互補(bǔ)性,并且有氫鍵形成。結(jié)論本研究可得出如下結(jié)論:1、膽紅素通過5-HT_(3A)受體增高阻塞性黃疸的痛閾。BDL后大鼠機(jī)械性痛閾和熱痛閾顯著升高,且腦脊液內(nèi)膽紅素水平增加。鞘內(nèi)注射膽紅素同樣增加大鼠痛閾,且可被5-HT_(3A)受體拮抗劑所抑制。同時(shí)5-HT_(3A)受體在膽紅素干預(yù)后表達(dá)明顯增加,且脊髓背角神經(jīng)元活性增加。2、膽紅素通過5-HT_(3A)受體影響GABA通路的功能。5-HT_(3A)受體激動(dòng)劑、膽紅素鞘內(nèi)注射均可增高大鼠痛閾,這種效應(yīng)可被5-HT_(3A)受體拮抗劑、GABA受體拮抗劑所抑制。同時(shí),5-HT_(3A)受體在培養(yǎng)的脊髓背角GABA能神經(jīng)元上大量表達(dá),且GABAA受體在膽紅素干預(yù)后蛋白表達(dá)明顯增加,GABA濃度在BDL和膽紅素鞘內(nèi)注射后顯著增加。3、膽紅素與5-HT_(3A)受體以氫鍵相結(jié)合。膽紅素能夠誘發(fā)HEK293-5-HT_(3A)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流,且放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)膽紅素同5-HT_(3A)受體的親和力較弱,提示兩者以共價(jià)鍵或離子鍵等結(jié)合的可能性較小。同源建模和分子對(duì)接進(jìn)一步證實(shí)了膽紅素能夠進(jìn)入5-HT_(3A)受體兩個(gè)亞基之間形成的疏水間隙,兩者在空間結(jié)構(gòu)上具有良好的互補(bǔ)性,并且有氫鍵形成。阻塞性黃疸中樞升高的游離膽紅素能夠與脊髓背角的5-HT_(3A)受體以氫鍵相結(jié)合,從而增強(qiáng)GABA能中間神經(jīng)元的活動(dòng),參與黃疸患者的痛閾增高。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 Von Frey 尖端足底刺激位點(diǎn)rn blot 蛋白測(cè)定提取：大鼠腹腔注射 2%的戊巴比妥鈉深氮中速凍。稱取適量組織加入 RIPA 裂裂解 1h，并在 4℃條件下 12000rpm 離元培養(yǎng)的蛋白提�。簵壢チ装鍍�(nèi)培養(yǎng)入 RIPA 裂解液后放置于冰上，用刮，并在低溫離心機(jī) 15000rpm 離心 20m白濃度：取 96 孔板，將配好的一定濃取 5μl 分別加入孔內(nèi)，并用去離子水補(bǔ)℃條件下孵育 10min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定

圖 2 BDL 后膽總管變化肝功能各指標(biāo)變化。TB、DB、IB、TBA、ALT、AS05 同 sham 組相比）DB(μmol/L) IB(μmol/L) TBA(μmol/L) 0.53±0.11 0.2±0.07 8.25±0.83 37.83±6.63* 1.9±0.64 178±12.5* 77.05±8.03* 13.1±3.09* 117.18±8.06* 56.8±11.86* 9.9±3.03* 87.73±10* 79.8±6.6* 14.03±1.88* 104.43±4.81* 液的生化結(jié)果顯示，BDL 后大鼠腦脊液內(nèi)游離膽

圖 3 膽紅素通過 5-HT3A受體影響大鼠痛閾。A：BDL 術(shù)后機(jī)械性痛閾顯著增高。B：BDL 后熱痛閾顯著升高。C：BDL 術(shù)后腦脊液內(nèi)游離膽紅素顯著升高，第三天達(dá)到峰值且維持在穩(wěn)定水平。D：鞘內(nèi)注射不同濃度膽紅素 20min 后腦脊液內(nèi)膽紅素濃度有明顯增加，鞘內(nèi)給藥成功。E：鞘內(nèi)給予膽紅素后機(jī)械性痛閾增加。F：鞘內(nèi)給予膽紅素后熱痛閾增加。G：在 BDL3d 的大鼠鞘內(nèi)注射不同劑量 5-HT3A受體拮抗劑昂丹司瓊后，黃疸大鼠升高的痛閾不同程度被抑制，且具有劑量依賴性。（三）5-HT3受體各亞基表達(dá)變化為了進(jìn)一步探究 5-HT3A受體在阻塞性黃疸大鼠痛閾升高中的作用，我們進(jìn)一步用 Western blot 方法檢測(cè) BDL 大鼠、膽紅素鞘內(nèi)注射大鼠以及膽紅素直接培養(yǎng)大鼠脊髓背角神經(jīng)元后 5-HT3受體各亞基的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，BDL 術(shù)后脊髓膨大段5-HT3A受體表達(dá)逐漸增加，在第三天表達(dá)顯著增高且穩(wěn)定（P<0.05），而 5-HT3B、5-HT3C、5-HT3D、5-HT3E的表達(dá)則無顯著改變（圖 4A、4B）。同樣，鞘內(nèi)注射 1000μM膽紅素后 5-HT3A受體同樣有顯著增加（P<0.05），而 5-HT3B、5-HT3C、5-HT3D、5-HT3E

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