發(fā)布時間：2020-09-21 14:16

　　 研究目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染的常見結(jié)局是從無癥狀攜帶者發(fā)展為慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細胞癌,是由乙肝病毒、宿主和環(huán)境相互作用的結(jié)果。病毒因素包括HBV的基因突變、基因型、病毒載量和HBeAg狀態(tài)等,其中HBV基因突變是影響病毒生物學特性的重要因素之一,常見的突變包括前S區(qū)的PreS 1和PreS 2缺失突變、BCP區(qū)的T1762/A1764雙突變、前C區(qū)的A1896突變等,HBV突變有可能改變病毒的復制能力和致病性、改變抗原表位而影響免疫應(yīng)答反應(yīng)、產(chǎn)生抗病毒藥物耐藥性等,既有可能引起持續(xù)感染,又有可能造成嚴重的肝細胞損傷。國內(nèi)外已有一些文獻報道了HBV基因突變與肝細胞癌的關(guān)系,研究表明前C區(qū)和BCP區(qū)某些突變可以影響HBeAg的表達、分泌或增加病毒復制能力,然而對前C區(qū)和BCP基因突變與肝癌關(guān)系的研究結(jié)果并不一致,對前S區(qū)的突變研究還比較有限,對上述觀點也有爭議,這可能與分析的樣本量較小以及研究設(shè)計類型有關(guān)。本研究旨在通過病例對照研究方法和Meta分析進一步探討HBV突變與肝細胞癌發(fā)生之間的關(guān)系。 研究方法:本研究以肝細胞癌患者為病例、選取慢性乙型肝炎(CHB)患者和無癥狀攜帶者(ASC)為對照,應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,應(yīng)用巢式PCR擴增,對PCR產(chǎn)物進行DNA測序,進行多位點突變檢測,用MEGA 4.0、DNASTAR 5.0和Bioedit 7.0軟件分析比對結(jié)果。通過對比分析HCC患者和CHB患者和ASC樣本HBV在前S區(qū)和核心啟動子區(qū)(Core promoter,CP)及前C區(qū)多個位點的突變發(fā)生率,分析HBV前S區(qū)、前C區(qū)和CP區(qū)基因突變與肝細胞癌的關(guān)系。Meta分析使用Cochrane協(xié)作網(wǎng)(www.cochrane.org)提供的Review Manager(RevMan)5.0和統(tǒng)計分析軟件Stata 9.1同時進行,系統(tǒng)全面檢索相關(guān)文獻、制定納入、排除標準和文獻質(zhì)量評價表、評價文獻質(zhì)量、統(tǒng)計分析集中報道的多個HBV突變位點,尤其是報道不一致的突變位點,期望通過擴大樣本量得到一個更加可靠的關(guān)于HBV突變與HCC關(guān)系的結(jié)論。使用Stata 9.1和SPSS 16.0軟件進行卡方檢驗、T檢驗和多因素Logistic回歸等統(tǒng)計分析。 研究結(jié)果:本研究對象均為成年患者,收集659例HCC、425例CHB、836例ASC血清標本,提取HBV DNA,成功擴增并且檢測出HBV前S和CP區(qū)HCC序列292條、CHB序列240條和ASC序列240條。 1、前S區(qū)的缺失和突變結(jié)果: (1)前S區(qū)PreS1、PreS2缺失突變、起始密碼子缺失突變和點突變: HCC共發(fā)生缺失突變79例,HCC和CHB兩組PreS區(qū)缺失突變比較,OR=2.16(1.17,4.00)。HCC和CHB中缺失類型均以preS2的5’端缺失最為多見。 (2)比較HCC和CHB兩組前S區(qū)的點突變,檢測HCC和CHB兩組PreS區(qū)C2857、A2875、T2931、T2940、A2946、A2950、A2951、G2962、A2964、T3026、T3051、T3054、T3060、A3063、A3066、T3026、T3054、T3060、A3066、G3069、T3116、A3120、G3186、C3191、T3216、C3222、T3225、C3246、G3264、C3267、C3268、A3291、T3320、T3324、T3350共35個點突變比較發(fā)現(xiàn),T2940、A2946、G2962、A2964、A3120、C3191、C3246、C3267、C3268、T3350共10個位點突變有意義。其中A2946、A3120、C3191、C3246、C3267五個位點的OR1,提示有保護作用。其它5個位點的OR1,可能是潛在的危險因素。 (3)對不同基因型中HCC組和CHB組PreS區(qū)基因突變比較分析 對CHB組中基因型B和基因型C兩組PreS區(qū)基因突變比較,有T2931、A2946、A2950、A2951、G2962、A2964、T3026、T3054、T3060、A3066、G3069、T3116、A3120、G3186、C3191、C3222、T3225、C3246、G3264、A3291、T3320、T3324、T3362多個突變位點具有統(tǒng)計學差異。 對基因型C中HCC組和CHB組PreS區(qū)基因突變進行了比較,其中A2951、G2962、A2964、T3054、T3060、A3066、G3069、T3225、C3246、C3268、A3291、T3350等12個位點突變具有統(tǒng)計學差異。 (4)對不同HBeAg狀態(tài)中HCC組和CHB組PreS區(qū)基因突變比較分析對CHB組HBeAg(+)和HBeAg(-)的PreS區(qū)基因突變比較,其中A2950、C3267、C3268有統(tǒng)計學差異。 對HBeAg陽性中HCC組和CHB組PreS區(qū)基因突變比較,其中T2940、A2946、G2962、A2964、A3063、A3066、A3120、C3191、T3225、C3267、C3268、T3350位點突變具有統(tǒng)計學差異。對HBeAg陰性中HCC組和CHB組PreS區(qū)基因突變進行了比較,G2962、A2964位點突變具有統(tǒng)計學差異。 (5)HCC和CHB兩組PreS1和PreS2區(qū)起始密碼子缺失和突變分析, HCC組以PreS2起始密碼子缺失13例,突變36例,突變中以ATG突變?yōu)锳TA最多;CHB組PreS2起始密碼子突變6例,兩組PreS2起始密碼子缺失和突變的OR=15.64[6.39,38.28]。HCC組PreS1起始密碼子缺失4例,突變2例,CHB組PreS1起始密碼子缺失2例,突變1例,PreS1起始密碼子缺失和突變的OR=2.44[0.60,9.97]。 2、前C區(qū)和CP區(qū)基因突變分析 (1)前C區(qū)和CP區(qū)基因點突變分析: 檢測前C區(qū)與CP區(qū)G1652、T1653、T1673、C1674、T1719、C1726、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、T1766、G1799、A1896、A1899和A1913共16個位點的突變差異。①HCC與CHB組比較,OR1的位點有:T1653、C1674、V1753、T1762、A1764、T1766、A1896、A1899。②HCC和ASC組比較,OR1的位點:T1653、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899;而OR1的位點有:T1719、T1727、G1799。③CHB和ASC組比較,OR1的位點:T1653、V1753、T1762、A1764、A1896;OR1的位點:T1719、T1727、G1730和G1799。 (2)不同基因型之間比較: 基因型B中,HCC與CHB和ASC比較,C1726、T1727、T1762、A1764有統(tǒng)計學差異;基因型C中,HCC與CHB和ASC比較,T1653、T1719、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位點突變率有統(tǒng)計學差異;HCC組中,基因型B與基因型C比較,G1652、T1653、T1673、C1674、T1719、C1726、G1730、V1753、T1762、A1764、G1799位點突變率有統(tǒng)計學差異,其中基因型B高于基因型C的位點:G1652、T1673、C1726、G1730、G1799,基因型C高于基因型B的位點:T1653、C1674、T1719、V1753、T1762、A1764;CHB組中,基因型B與基因型C比較,G1652、T1653、C1674、T1719、C1726、T1727、G1730、T1762、A1764、G1799位點突變率有統(tǒng)計學差異,其中基因型B中突變率高于基因型C的位點:G1652、T1673、C1726、T1727、G1730、G1799,基因型C高于基因型B的位點:C1674、T1719、T1762、A1764,而T1653、V1753突變率無統(tǒng)計學差別;ASC組基因型B中突變率高于基因型C的位點:C1726、T1727、G1730、G1799、A1896、A1899,基因型C高于基因型B的位點:T1719,而T1762、A1764突變率無統(tǒng)計學差別。 (3)不同HBeAg之間比較: 在HBeAg(+)的HCC組和CHB組比較,T1653、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位點的突變率有統(tǒng)計學差異;在HBeAg(-)的HCC組和CHB組比較,T1653位點的突變率有統(tǒng)計學差異;HCC組不同HBeAg狀態(tài)PC/BCP/EnhⅡ區(qū)基因突變比較,在A1896、A1899位點有統(tǒng)計學差異;CHB組不同HBeAg狀態(tài)PC/BCP/EnhⅡ區(qū)基因突變比較,在T1653、T1719、C1726、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位點有統(tǒng)計學差異。 (4)聯(lián)合突變比較分析: 在HCC、CHB、ASC三組突變率有統(tǒng)計學差異的位點中,分析多個位點聯(lián)合突變的組合模式和發(fā)生情況。CHB組中野生型的比例(67.51%)明顯高于HCC組(28.85%)。雙突變中HCC、CHB和ASC組中均以T1762/A1764最為常見,分別占75.48%、44.67%和18.75%。HCC與CHB、ASC兩組或三組卡方檢驗,野生型、雙突變和三突變均具有統(tǒng)計學差異。 3、單因素和多因素Logistic分析: ①HCC組和CHB組比較,采用平行分組的單因素Logistic回歸分析。篩選出有意義的變量:Age、Gender、HBeAg、AFP、ALT、T1653、V1753、T1762、A1764、T1766、T1727、A1896、A1899、C1674、PreS、C3222、A3063、A312、T3051、T3116、T3216、G2962。②將單因素Logistic回歸分析篩選的變量納入多因素Logistic回歸分析,采取逐步回歸的方法,進一步篩選多元回歸變量,最后HCC和CHB組比較,HCC的發(fā)生與C1674、T1766、A1899、V1753和G2962等多個位點突變及年齡、HBeAg、HbcAb等危險因素有關(guān)。3、Meta分析, (1)突變位點的合并OR值 根據(jù)文獻納入標準和排除標準,共納入文獻43篇,其中病例對照研究40篇,隊列研究3篇。累計納入分析2720例HCC病例和6059例對照,6個突變位點合并的OR和95%CI分別是:PreS:OR=3.77,95%CI(2.57-5.52),T1653:OR=2.76,95%CI(2.09-3.64),V1753:OR=2.35,95%CI(1.63-3.40),T1762/A1764:OR=3.79,95%CI(2.71-5.29)。其中T1653,V1753和T1762/A1764位點的合并OR值HBeAg(+)組高于HBeAg(-),低質(zhì)量文獻組高于高質(zhì)量文獻組,在基因型之間也存在差異。而A1896:OR=1.15,95%CI(0.83-1.60)和T1858:OR=1.14,95%CI(0.39-3.29)突變與HCC發(fā)生無明確的統(tǒng)計學差異。 (2)發(fā)表性偏倚和敏感性分析 對各個分析合并的位點利用Egger檢驗和漏斗圖進行發(fā)表性偏倚分析,只有Pres位點存在發(fā)表性偏倚,Egger's test:P=0.01,95%CI(1.286,6.798),漏斗圖不對稱,存在發(fā)表性偏倚。其余各個位點漏斗圖基本對稱,Egger檢驗P0.10。敏感性分析少數(shù)位點對某些研究比較敏感,但是不會對結(jié)果造成明顯影響,不會逆轉(zhuǎn)結(jié)果。 (3)聯(lián)合突變分析基因突變對診斷和預測HCC的評價 PreS,T1653,V1753和T1762/A1764從ASC、CHB、LC、HCC發(fā)展過程中突變不斷累積,突變率逐漸增加(Ptrend0.001),T1762/A1764對預測HCC有較高的特異性,其靈敏度為70.6%,特異度為60.6%;而T1762/A1764+T1653聯(lián)合突變的靈敏度為43.4%,特異度為84.2%;T1762/A1764+V1753聯(lián)合突變的靈敏度為51.7%,特異度為80.4%;T1762/A1764+T1653+V1753聯(lián)合突變的靈敏度為24.3%,特異度為93.9%。聯(lián)合突變可明顯提高預測HCC的特異性,但是靈敏度也隨之降低。 從ASC向CHB、LC、HCC發(fā)展過程中,HBV的突變率逐漸增加,PreS位點突變率從10%到48.20%,而T1762/A1764位點各階段突變率分別為28.26%,49.87%,70.55,70.64%。 研究結(jié)論:HBV PreS,T1653,V1753和T1762/A1764突變增加HCC發(fā)生的危險,這些單個或聯(lián)合突變對早期檢測和發(fā)現(xiàn)HCC有重要臨床意義,檢測這些突變有利于抗病毒治療的篩選和HCC預測。需要進一步研究這些突變與宿主的相互作用和發(fā)展檢測這些突變的方法用于預測HCC。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R512.6;R735.7
【部分圖文】：

前 言全世界大約有 30 億人曾經(jīng)感染過乙型肝炎病毒，約占世界總?cè)丝诘囊话耄饕植荚趤喼藓头侵蓿▓D 1）。其中 5%~10%的人發(fā)展為慢性攜帶者，而這當中的 20%左右最終將死于與 HBV 相關(guān)的嚴重肝病，15~40%將進展為肝硬化、肝癌或肝衰竭，中國每年因感染乙型肝炎病毒而導致發(fā)病的人數(shù)達到 50~100 萬（圖 2），每年約有 30萬人死于肝硬化和肝癌，給個人和社會帶來沉重的負擔。中國是乙型病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，據(jù) 1992 年全國病毒性肝炎血清流行病學調(diào)查，全國的平均感染率 10％，2006年第三次全國乙型肝炎血清流行病學調(diào)查，中國乙肝的平均感染率為 7.18％，中國累計有 7 億人曾感染過乙型肝炎病毒，有 1.2 億人攜帶乙型肝炎病毒，乙肝病毒感染是慢性肝炎的主要致病因素之一[1, 2]，HBV 感染及肝細胞癌(HCC)的發(fā)生在中國已經(jīng)成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，而且已經(jīng)成為威脅人類健康的全球性問題。

- 12 -圖 3 HBV 分子結(jié)構(gòu)乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝病毒科(hepadnaviridae)正類嗜肝病毒屬(orthohepadnavirus)，HBV DNA 由不完全的環(huán)狀雙鏈 DNA 組成，長的為負鏈，短的為正鏈，負鏈約含 3200 堿基（base pair，bp），正鏈的長度可變，相當于負鏈的50%~80%，HBV 基因組中包含 4 個開放讀碼框（open reading frame，ORF），均位于負鏈，分別是 S 區(qū)、C 區(qū)、P 區(qū)和 X 區(qū)（圖 3），分別編碼外膜蛋白、核殼、聚合酶和 X 蛋白，X 蛋白因開始鑒定時對其基因產(chǎn)物的功能不明而稱 X，其中 S 區(qū)又分為前 S1、前 S2 和 S 三個編碼區(qū)，分別編碼 PreS1、PreS2 和 HBsAg 蛋白，C 區(qū)又可分為前 C 區(qū)（precore）和核心區(qū)（core），分別編碼 HBeAg 和 HBcAg。由雙鏈 DNA 轉(zhuǎn)錄為 RNA 是一個需要高度調(diào)節(jié)的過程。因而病毒基因組不僅含有編碼蛋白的結(jié)構(gòu)基因，也有調(diào)節(jié)元件，作為調(diào)節(jié)元件的一段 DNA 序列可與某些細胞蛋白或病毒蛋白結(jié)合正性或負性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，分散在整個 HBV 基因組中有多個調(diào)節(jié)

- 14 -（引自 Gamen D,et al.N Engl J Med 2004;350:1118-29）增強子(enhancer)是指能使他連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的 DNA 序列，其功能主要是通過與調(diào)節(jié)蛋白相互作用刺激特定的一個或一組基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，常由一個或多個連續(xù)或不連續(xù)的 DNA 序列元件組成，并與特異的蛋白質(zhì)相互作用，這些DNA 結(jié)合蛋白可由病毒本身編碼，也可由宿主細胞編碼，HBV 的兩個增強子分別為Enh I 和 EnhⅡ。Enh I 在 S 基因和 X 基因之間，大約在 1070-1234nt 前后加減 100 bp的區(qū)段，Enh I 定位在 P 基因中，末端與 X 基因啟動子重疊，可增強 C、SP I、SPⅡ和 X 啟動子的轉(zhuǎn)錄，如對下游的 C 啟動子比對 X 啟動子的增強作用高 60 倍，Enh I

【共引文獻】

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本文編號：2823590