隨著以拉米夫定為代表的新一代核苷類似物在我國慢性乙型肝炎患者中的廣泛應(yīng)用，核苷類似物耐藥成為目前臨床關(guān)注的焦點(diǎn)問題。我們對在我科接受拉米夫定治療的247例慢性乙型肝炎患者進(jìn)行跟蹤隨訪，每三個(gè)月檢測一次患者肝功能和病毒學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)拉米夫定治療6個(gè)月，94％患者HBV DNA降至1×10~5copies／ml以下，76％患者ALT轉(zhuǎn)為正常(小于1倍ULN)，HBeAg累積血清學(xué)轉(zhuǎn)換率隨著治療時(shí)間的延長逐漸增高，1年為16.08％，2年為33.75％，3年為47.00％。治療前ALT水平高于3×ULN者發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換比例明顯高于低于3×ULN者(P=0.0316)。因此在選擇治療病例時(shí)應(yīng)盡量選擇治療前ALT超過3×ULN者，以期獲得更好的持續(xù)應(yīng)答。隨著拉米夫定用藥時(shí)間的延長，YMDD變異的累積發(fā)生率逐漸增高，YMDD變異的累積發(fā)生率在治療1年時(shí)為8.33％，治療2年為25.79％，治療3年為41.30％，治療4年為51.97％。治療前HBV DNA水平高于25pg／ml者YMDD變異發(fā)生率明顯高于DNA水平低于25pg／ml者(P=0.0224)。在出現(xiàn)YMDD變異的42例患者中，有32例患者表現(xiàn)有肝功能的異常(超過2倍ULN)，35例患者出現(xiàn)HBV DNA反跳(超過1×10~5拷貝／ml)，但發(fā)生YMDD變異患者平均HBV DNA水平仍遠(yuǎn)低于治療前HBV DNA水平，ALT、AST水平與治療前相比無明顯差異。出現(xiàn)YMDD變異后，HBeAg陽性患者ALT上升的最高值較HBeAg陰性患者明顯較高，這可能與HBeAg陽性患者原有的疾病活動程度較高有關(guān)。從我們的研究結(jié)果看，拉米夫定具有較強(qiáng)的抗病毒作用，患者可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得病毒學(xué)和生化應(yīng)答，長期治療還可獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，從而減少停藥后復(fù)發(fā)的機(jī)會。但拉米夫定長期治療過程中耐藥性的產(chǎn)生及由此引發(fā)部分患者肝功能和病毒水平的反跳應(yīng)引起臨床醫(yī)生的密切關(guān)注。在決定是否延長拉米夫治療期限時(shí)要權(quán)衡延長治療帶來的抗病毒效果與耐藥性的產(chǎn)生可能帶來的病情復(fù)發(fā)之間的利弊關(guān)系。 我們采用本室先前建立的RFLP方法篩檢YMDD變異并將其應(yīng)用于臨床監(jiān)測拉米夫定治療過程中耐藥性的產(chǎn)生，取得了較好的效果。由于RFLP的局限性，我們對篩檢YMDD變異陽性的標(biāo)本進(jìn)行了P基因測序，以進(jìn)一步了解拉米夫定耐藥株的P基因A-E區(qū)序列特點(diǎn)。結(jié)果顯示，DNA測序的結(jié)果與RFLP篩檢的結(jié)果完全吻合，證明RFLP是簡便、可靠的。我們的研究中YVDD變異較少伴有rtL 180M點(diǎn)突變，這是否同中國感染的HBV毒株的基因型有關(guān)目前尚不清楚，需要擴(kuò)大樣本量才能得出可信的結(jié)論。為更詳細(xì)了解P基因YMDD以外的突變，對19例患者 P基因A一E區(qū)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)19例患者中有10例除了發(fā)生YMDD變異外還有P 基因A一E區(qū)其他部位氨基酸的突變，有5種點(diǎn)突變同時(shí)在2個(gè)以上的患者中發(fā)生， 包括rtL80I，rtV84M，rtG172E，找C174C和rtG172E/rtG174C聯(lián)合突變，這幾種突 變在參考序列中未發(fā)現(xiàn)(已經(jīng)與GeneBank中202株HBv全序列進(jìn)行對比).rtL80I， rtV84M變異與YMDD變異同時(shí)發(fā)生，形成YMDD的伴隨突變。而rtG172E，rtG174C 和rtG 1 72E/rtG174C變異多單獨(dú)存在，較少與YMOD變異同時(shí)發(fā)生，可能有一定 的臨床意義。但這些位點(diǎn)的突變是否與核普類似物耐藥有直接關(guān)系還有待體外實(shí)驗(yàn) 進(jìn)一步證實(shí)。由于S基因與P基因完全重疊，因此P基因核普酸的改變可能會影 響到S基因的表達(dá)，P基因YMDD變異中YVDD變異引起S基因1195M的改變， 而YIDD變異則引起S基因W196L或W1965的改變。本研究中還有2例患者中分 別因?yàn)镻基因rt083N和rtMZo4I變異導(dǎo)致HBsAg的表達(dá)提前出現(xiàn)終止，但患者仍 表現(xiàn)為HBsAg陽性，說明在患者中這種提前終止的變異株均與野毒株同時(shí)存在。 為進(jìn)一步研究變異毒株的生物學(xué)意義，我們通過定向點(diǎn)突變，成功的在模板 P3.Sll的基礎(chǔ)上構(gòu)建了五種P基因變異株，并在此基礎(chǔ)上將包含不同突變點(diǎn)的全基 因質(zhì)粒通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HePGZ細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的檢測結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，五種不同的P基因變異株均可表達(dá)并分泌HBsAg和HBeAg，證明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在 細(xì)胞內(nèi)可正常表達(dá)和分泌，但五種變異株與野株相比，S加值相差不多，說明這五 種P基因變異對S基因表達(dá)的抗原并無明顯影響。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)核心顆粒DNA 通過Rea卜Time PCR檢測的初步結(jié)果提示，YMDD變異株的復(fù)制活性只有野毒株 的1/10，而rtG172E和rtG174C變異株的復(fù)制活性也較野毒株下降，聯(lián)合變異 rtG 1 72E/rt G174C復(fù)制活性下降更為明顯。但要最終確定病毒復(fù)制活性的變化，下 一步還需要用Southern Blot進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R512.62

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本文編號：2819710