[研究背景及目的]病毒性肝炎是由多種不同嗜肝病毒包括甲、乙、丙、丁以及戊型肝炎病毒或其他病毒如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等,引起的一組以肝臟損害為主要臨床特征的急或慢性傳染病,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染在中國仍然較為普遍,人群攜帶率高達(dá)7.18%。由其發(fā)展的重型病毒性肝炎(fulminant viral hepatitis, FVH)或者肝功能衰竭病情極為兇險(xiǎn),是一類在短期內(nèi)出現(xiàn)肝細(xì)胞的大量壞死、嚴(yán)重肝功能不良甚至合并嚴(yán)重并發(fā)癥如肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝腎綜合征等為臨床特征的嚴(yán)重肝臟疾病。由于臨床上缺乏有效特異的治療措施和干預(yù)手段,若不及時(shí)進(jìn)行肝移植,其臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后非常差。有研究證實(shí)3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain 3, MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎,其病程轉(zhuǎn)歸及疾病預(yù)后和人類FVH相似,因此目前是研究FVH良好的動(dòng)物模型之一。FVH的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,肝炎病毒感染并在肝細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制,通常不直接引起肝細(xì)胞變性壞死,肝細(xì)胞損傷主要是由于宿主針對病毒產(chǎn)生的一系列免疫應(yīng)答尤其是細(xì)胞免疫造成的,其中針對肝炎病毒蛋白抗原特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞(CTL)對于肝炎病毒的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸具有關(guān)鍵作用,然而其他免疫細(xì)胞尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在FVH中的作用尚未完全明確。研究證實(shí)肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞是肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分,由病毒誘導(dǎo)的人類小鼠和肝臟疾病中會(huì)發(fā)生肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞的大量聚集。肝臟在慢性病毒性肝炎過程中維系著一種免疫耐受的狀態(tài),其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體維持自身免疫耐受的重要細(xì)胞組分,在保持生理狀態(tài)機(jī)體免疫平衡、移植免疫耐受、自身免疫性疾病等病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前在肝臟疾病研究較多的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中是CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg),主要可以通過分泌的抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)以及轉(zhuǎn)移生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)來發(fā)揮其抑制性的免疫調(diào)節(jié)的作用。除此以外,越來越多的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞被證實(shí),如自然殺傷性T細(xì)胞(natural killer T cell, NK T)、CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell, DN T細(xì)胞)、γ8T細(xì)胞等。然而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在不同的疾病模型中其表型和功能存在明顯差異,比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)中DN T細(xì)胞能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體；在立什曼原蟲感染中,TCRαβ+DN T細(xì)胞可發(fā)揮促進(jìn)了炎癥發(fā)展的作用；Treg在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,通過表達(dá)纖維蛋白原樣蛋白／纖維介素2(fibrinogen like protein 2/fibroleukin, fgl2)促進(jìn)暴發(fā)型肝炎的發(fā)生等。γδT細(xì)胞是一種表型和功能獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞,主要由CD4-CD8-γδT細(xì)胞亞群組成,僅少數(shù)為CD4-CD8+γδT細(xì)胞亞群。目前對于DN T細(xì)胞以及γδT細(xì)胞在FVH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用的相關(guān)報(bào)道較少。fg12包括跨膜型以及分泌型并發(fā)揮不同的功能。其中跨模型fg12是一種新型的凝血酶原酶分子,主要由活化的巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),通過促進(jìn)凝血酶原的裂解以及纖維蛋白的沉積,最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙和肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生,在FVH中肝細(xì)胞缺氧性損傷和大量炎性壞死的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究室前期研究結(jié)果顯示,通過干擾小鼠體內(nèi)龜12的表達(dá),可導(dǎo)致暴發(fā)性肝炎小鼠的生存率顯著升高。有研究證實(shí)Treg可以通過產(chǎn)生分泌型fg12促進(jìn)暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其他免疫細(xì)胞如DN T細(xì)胞與fg12的關(guān)系尚無研究。本研究室前期結(jié)果提示MHV-3在感染BALB/cJ小鼠后,有一群表型功能均與以往報(bào)道不同的DN T細(xì)胞,在疾病進(jìn)程中出現(xiàn)數(shù)量的顯著增加及大量活化,同時(shí)表達(dá)fg12分子,轉(zhuǎn)移過繼這群細(xì)胞會(huì)促進(jìn)小鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其深入的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。為探索DN T細(xì)胞及γδT細(xì)胞在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中的作用及機(jī)制,本課題具體研究目標(biāo)如下：1.研究脾臟DN T細(xì)胞mfgl2的表達(dá)及促凝血功能2.研究脾臟DN T細(xì)胞通過表達(dá)mfgl2促進(jìn)暴發(fā)型肝炎發(fā)生的機(jī)制3.初步探索肝臟DN T細(xì)胞促進(jìn)NK細(xì)胞活化的機(jī)制4.研究肝臟γδT細(xì)胞在小鼠暴發(fā)性肝炎中的作用及機(jī)制[研究方法]1.采用MHV-3經(jīng)腹腔注射途徑感染BALB/cJ小鼠建立暴發(fā)性小鼠肝炎模型,在不同感染時(shí)間點(diǎn)Oh、24h、48h以及72h時(shí)對小鼠肝組織行伊紅-蘇木精染色(HE染色),觀察肝臟病理學(xué)改變,并檢測血清ALT和AST水平。2.磁珠分選正常以及MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟DN T細(xì)胞,通過免疫共聚焦法檢測其mfgl2的表達(dá),并通過促凝活性檢測實(shí)驗(yàn)(procoagulant assay, PCA)體外檢測脾臟DN T細(xì)胞的功能。3.使用特異性針對mfgl2的microRNA腺病毒體內(nèi)干擾BALB/cJ小鼠的mfgl2表達(dá),并通過尾靜脈過繼MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟DN T細(xì)胞,觀察小鼠生存率,檢測肝臟病理學(xué)改變及血清ALT和AST水平變化,同時(shí)通過real-time PCR以及western blot來檢測肝臟mfgl2的分子及蛋白水平的表達(dá)情況。4.尾靜脈過繼MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的DN T細(xì)胞,觀察小鼠肝臟內(nèi)NK細(xì)胞的CD69表達(dá)情況,體外將感染48h時(shí)分離的肝臟DN T細(xì)胞以及感染24h分離的肝臟NK細(xì)胞,體外共培養(yǎng)12h后,體外檢測CD69表達(dá)、胞內(nèi)干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌,以及利用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測NK細(xì)胞對原代肝細(xì)胞的殺傷作用的變化。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞在肝臟、脾臟和外周血等器官的比例數(shù)量以及活化水平變化,同時(shí)檢測肝臟γδT細(xì)胞的表面分子包括CD25、CD28、CD30、CD44的表達(dá),通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測MHV-3感染前后肝臟γδT細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、IFN-γ、TNF-α、穿孔素(perforin)、顆粒酶(granzyme B)等細(xì)胞因子譜的水平,檢測γδT細(xì)胞表面α-Galcer二聚體來鑒定γδT細(xì)胞是否為傳統(tǒng)的NKT細(xì)胞。6.磁珠分選肝臟γδT細(xì)胞,原位灌流膠原酶消化法分離小鼠原代肝細(xì)胞,利用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測肝臟γδT細(xì)胞在體外對原代肝細(xì)胞的殺傷作用,體外使用單克隆抗體阻斷IFN-γ、TNF-α來驗(yàn)證肝臟γδT細(xì)胞損傷肝細(xì)胞的主要分子途徑。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1.MHV-3感染BALB/cJ小鼠后,隨著感染時(shí)間的延長,肝臟組織病理學(xué)首先出現(xiàn)肝細(xì)胞嗜酸性變以及氣球樣變,形成點(diǎn)狀和局灶狀壞死,伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤,最后出現(xiàn)大面積肝細(xì)胞破壞,網(wǎng)織纖維塌陷等改變。同時(shí)BALB/cJ小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT, AST水平顯著升高,在感染后72h時(shí)分別達(dá)到最高值(9418.7±23.6 IU/L,8195.3±224.0 IU/L)。2.通過免疫共聚焦法檢測發(fā)現(xiàn)MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟DN T細(xì)胞高表達(dá)mfgl2,與前期real-time PCR和western blot的檢測結(jié)果相一致。mfgl2集中在DN T細(xì)胞膜上表達(dá),初步證實(shí)為跨模型mfgl2。另外體外促凝活性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示這群表達(dá)mfgl2的DN T細(xì)胞在體外具有PCA活性(0h為30.30±52.48mU/ml,48h為651.51±301.80 mU/ml),進(jìn)一步驗(yàn)證該mfgl2分子為傳統(tǒng)跨模型mfgl2.3. BALB/cJ小鼠體內(nèi)使用特異性針對mfgl2的microRNA腺病毒可有效干擾肝內(nèi)mfgl2分子及蛋白水平的表達(dá),使生存率提高至33.3%,同時(shí)顯著改善肝臟組織病理學(xué)改變,降低血清ALT、AST水平,在這種情況下,尾靜脈高壓注射MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟DN T細(xì)胞會(huì)逆轉(zhuǎn)mfgl2 microRNA的干擾作用,導(dǎo)致肝內(nèi)mfgl2表達(dá)水平升高,發(fā)生明顯肝組織病理學(xué)改變,血清ALT、AST水平顯著升高,小鼠全部死亡。4.尾靜脈過繼MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠體內(nèi)分離的DN T細(xì)胞后24h,小鼠肝臟內(nèi)NK細(xì)胞表達(dá)CD69的水平顯著升高,出現(xiàn)明顯活化。將肝臟DN T細(xì)胞以及NK細(xì)胞體外共培養(yǎng)12h, DNT細(xì)胞可促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)CD69比例增加,同時(shí)分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α水平升高,NK細(xì)胞對原代肝細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),MHV-3感染BALB/cJ小鼠48h時(shí),無論在外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細(xì)胞的比例較正常時(shí)顯著升高,絕對計(jì)數(shù)結(jié)果顯示隨著感染時(shí)間的延長,外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細(xì)胞的總數(shù)顯著下降。肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞表面高表達(dá)CD44分子,但無明顯CD25、CD28及CD30分子的表達(dá),經(jīng)鑒別該群γδT細(xì)胞并非傳統(tǒng)的NK T細(xì)胞,同時(shí)隨著感染時(shí)間的延長,γδT細(xì)胞表達(dá)活化分子CD69的比例顯著升高。對肝臟γδT細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子譜檢測發(fā)現(xiàn),感染后的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ及TNF-α水平明顯增加,其他細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、perforin、granzyme B無明顯表達(dá)。6.通過LDH釋放殺傷實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),MHV-3感染BALB/cJ小鼠48h肝臟內(nèi)分離的γδT細(xì)胞對感染的原代肝細(xì)胞隨著效靶細(xì)胞比例的升高其體外殺傷作用明顯增強(qiáng),單用或合用IFN-γ及TNF-α的單克隆阻斷性抗體,可顯著降低γδT細(xì)胞對原代肝細(xì)胞的殺傷作用,以TNF-α阻斷后的效果更明顯。[結(jié)論]1.本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果更深入探討了DN T細(xì)胞通過高表達(dá)膜型mfgl2分子,促進(jìn)免疫凝血的作用,導(dǎo)致大量肝細(xì)胞的炎性壞死,最終誘導(dǎo)了暴發(fā)型病毒性肝炎的發(fā)生。2.DN T細(xì)胞體內(nèi)及體外均可促進(jìn)NK細(xì)胞的活化,并誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子,增強(qiáng)NK細(xì)胞對肝細(xì)胞的殺傷作用,可能為DN T細(xì)胞促進(jìn)暴發(fā)型小鼠肝炎的發(fā)生的另一條途徑。以上兩個(gè)方面的研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù),亦為臨床上暴發(fā)型病毒性肝炎的免疫學(xué)治療提供了重要的靶點(diǎn)。3.γδT細(xì)胞在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,其比例在感染后顯著增加并發(fā)生活化,同時(shí)高表達(dá)炎性細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α,并通過依賴IFN-γ及TNF-α的分子途徑來發(fā)揮殺傷肝細(xì)胞的作用,在暴發(fā)型病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.1

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本文編號：2818570