慢性乙型肝炎是我國(guó)的高發(fā)疾病之一，是導(dǎo)致肝纖維化和肝癌的主要原因。目前治療慢性乙型肝炎的藥物主要是以拉米呋啶和阿的福韋等核苷類似物為主的抗病毒藥物和以α干擾素為主的免疫調(diào)節(jié)劑，但是臨床治療效果不甚滿意。 RNA干擾是近年來生命科學(xué)的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)，其原理是同源雙鏈RNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過對(duì)目標(biāo)基因mRNA的特異性切割或降解作用，導(dǎo)致目標(biāo)基因的不表達(dá)或減效表達(dá)。該現(xiàn)象是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一個(gè)重要機(jī)制，也是一種古老的抵御外來病原侵入的防御機(jī)制，在植物，線蟲，果蠅和哺乳動(dòng)物中廣泛存在。在成熟的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，超過30核苷酸的長(zhǎng)雙鏈RNA激活蛋白激酶R(PKR)和2-5’寡腺苷酸(OAS)途徑，引起干擾素樣的非特異性抑制，而不能引起高效特異的基因沉默，并不能特異有效的抑制同源基因的表達(dá)，這使得RNA干擾在一段時(shí)間內(nèi)沒有更好的推廣。2001年Tuschl研究小組證實(shí)21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小雙鏈干擾RNA(small interfering RNA．siRNA)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能引起同源的內(nèi)源基因的表達(dá)沉默，從而使RNA干擾技術(shù)開始走向人類疾病的實(shí)驗(yàn)治療研究。RNA干擾具有高效，特異，快速，無明顯副作用等優(yōu)點(diǎn)，很快被應(yīng)用于抗病毒，生物體基因的表達(dá)，調(diào)控和功能分析。在抗(?)-1，脊髓灰質(zhì)炎病毒，流感病毒等人類致病病毒 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 的實(shí)驗(yàn)研究中均取得較理想的結(jié)果，在轉(zhuǎn)錄后水平顯著抑制病毒的復(fù)制和蛋白表 達(dá)柞用強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了反義核酸和核酶技術(shù)。 HBV的復(fù)制是一個(gè)DNA一RNA一DNA的過程，其中HBV的前基因組RNA逆 轉(zhuǎn)錄成正鏈CDNA，和單鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈松弛DNA的步驟，均在細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn) 行因此可能成為RNA于擾的個(gè)很好的靶點(diǎn)。 本.實(shí)驗(yàn)勝要目的是研究R卜A千擾在抗HBV中的作用。首先初步建立載體法 篩選、IRN八的模型:利用綠熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的特征，構(gòu)建目的基因和 F曰干融合基因表達(dá)載體，同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)HBV基因組序列的ShRN八，構(gòu)建、hRN八 表任載體，在哺乳細(xì)胞中篩選、iRNA靶位，為今后RNA一干擾相關(guān)研究打卜基礎(chǔ) 其次，在川飛V持續(xù)復(fù)制和病毒蛋白表達(dá)的細(xì)胞模型一HePG2.215細(xì)胞中觀察研究 R卜八卜擾對(duì)病毒復(fù)制和蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證靶位的有效性〕 論文一有效siRNA篩選體系的建立 1 .E(，F(xiàn)P和HBs融合基因組載體(pEGFP一S)的構(gòu)建和功能鑒定 次pd)NA3.l十S載體為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，高保真PCR法擴(kuò)一增不含終l卜 密‘，馬的全長(zhǎng)HBs基因片段，經(jīng)雙酶切連接后，融合到pEGI了PN一!載體FGFP基因 的\端，然后通過特異性I“CI之反應(yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切法及核酸序列測(cè)定方法篩 選和鑒定有效克隆。淺R法和酶切法結(jié)果均表明插入片斷與預(yù)期長(zhǎng)度相符。序夕lj 測(cè)序結(jié)果與衍enbank相‘、女序列吻合。重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染日ePGZ細(xì)胞后，24小時(shí) 后丁以觀察到綠熒光的表達(dá)，提示該載體可以作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)融合蛋白變化的模型 2.不司靶位和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的、hR\八表達(dá)載體的構(gòu)建 利用如:二n以在線、、R卜八搜索和設(shè)計(jì)工具，針對(duì)HBVS基因序列選擇并設(shè)計(jì) 由})N入片斷，插入pA\U6十夕載體的U6十27 RNA啟動(dòng)子后端，構(gòu)建成勸R\八 表達(dá)載體一pCR法和核酸測(cè)序萬法篩選和鑒定有效克隆。測(cè)序紀(jì)果與預(yù)期一致。 飛.洲:}一曰廠}’融合蛋門熒光表達(dá)的檢測(cè) p‘心fP一S分別和不同位點(diǎn)的shRNA表達(dá)載體DNA脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染/\l)293細(xì) 飽，軒染后24一72}:，使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光細(xì)胞表達(dá)的情沉，流式細(xì) 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 胞儀檢測(cè)細(xì)胞總熒光強(qiáng)度。鏡廠觀察到不同組細(xì)胞的綠熒光蛋白川3、一以洲”較空載 體和無關(guān)對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)度均減弱，熒光細(xì)胞數(shù)減少;轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，。AVU6+1、卜123〔，、 「)八冷64、、。:飛灑、泌訓(xùn)6、4、為5了，和t)AVu6月一4、h691組細(xì)胞熒光相對(duì)表達(dá)率較空載體對(duì) 照組分別降低56.2%、招.了%、胡.8%和63.1%，而無關(guān)對(duì)照組較空載體對(duì)照組_無明 顯:文變 }‘，}片;隊(duì)日，融合基因:二RNA表達(dá)水平的檢測(cè) 共轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收獲細(xì)胞，抽提細(xì)胞RNA及逆轉(zhuǎn)錄，普通半定量逆轉(zhuǎn)錄 一聚合酶鏈反應(yīng)(Rl七PCR)法檢測(cè)不同組對(duì)HBs一EGFP融合基因mRNA的影響。 R’卜尸(R泄;顯示不同位點(diǎn)的ShRN八表達(dá)載體對(duì)HBS一EGFP rnRNA的表達(dá)的影響有 任買毛異一第239、359對(duì)HBS一于一(，「P mRNA的抑制率分別為69.67叭，、73，2%、74.7% 和 64，‘7%，賓中579位點(diǎn)的抑制效果最好，無關(guān)序列和空載體的作用無明顯差別 同時(shí)采用熒紀(jì)染料法對(duì)f八\;l戶車::15了9組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量P(’R檢測(cè)，結(jié)果顯 示幾價(jià)丫卜斤:、「飛579組較空載體紛顯著抑制l招、一巨(;l}’融合基因m朋了、的表達(dá)，抑制率 達(dá)到川呢 5.小1司發(fā)少、結(jié)構(gòu)的、hRNA對(duì)RNAi的影響 分對(duì)同位點(diǎn)的不同發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HePGZ一2.!5細(xì)胞后，熒 光、〔量P(R檢測(cè)HBv。x)N八水平的變化。4、9、1‘)個(gè)核營(yíng)酸〔，飛uele、)tide，11t) 結(jié)構(gòu)、hR卜A表達(dá)載體組抑制附丫1價(jià)八的表達(dá)，抑制率分別為沛.}‘%，、!4藝%和6丫.當(dāng)， 結(jié)喂發(fā)現(xiàn)小·?
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R512.6
【部分圖文】：

構(gòu)建HBsAg和GF去除HBVS基因序列中的，而pEGFPN一1上也含有唯一p的酶切產(chǎn)物(圖3)。選擇序列完全一致。同時(shí)，抽，可見綠熒光蛋白表達(dá)(細(xì)胞后，表達(dá)熒光的陽性%、135。前者的表達(dá)熒光蛋123

E「圖2:不同載體轉(zhuǎn)染的HePGZ細(xì)胞中HBS一EGFP融合蛋白的熒光表達(dá)情況FigZ:ExPressionofHBs一EGFPinHePGZcellstransfeetedwithdifferentveetorsAandB:transfeetedwithPEGFPN一1DNA;CandD:transfeetedwithPEGFP一5DNA;EandF:non-transfeetedwithDNA(二)HBvRNA靶位的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

不同位點(diǎn)HISVRNA的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

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本文編號(hào)：2811103