隨著肝臟外科手術(shù)的廣泛開展,手術(shù)中因阻斷肝臟血供而導(dǎo)致的缺血再灌注(ischemia reperfuion,IR)損傷越來越得到重視。最先由Jennings于20世紀(jì)60年代報(bào)道。主要指缺血缺氧的組織器官在重新獲得血供氧供后,其功能不但沒有恢復(fù),反而其結(jié)構(gòu)功能和組織代謝破壞加劇的現(xiàn)象。免疫失衡是致使肝臟損傷的最重要緣由,固有免疫和適應(yīng)性免疫在IR過程中起到關(guān)鍵的作用。如何調(diào)控免疫平衡是目前肝臟IR損傷治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Roquin-1已證實(shí)在固有免疫及免疫平衡中起到重要的作用。其含有的RING指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶的活性。在T細(xì)胞中,它可以連接AMPK并調(diào)控其泛素化,進(jìn)而影響T細(xì)胞亞群的分化和功能。同時(shí),其C3H1鋅指結(jié)構(gòu)域和ROQ結(jié)構(gòu)域和mRNA的3’-UTR結(jié)合,并影響mRNA的半衰期。在IR損傷領(lǐng)域,在通過抑制MCP-1建立的心臟IR模型中發(fā)現(xiàn)Roquin-1的mRNA表達(dá)升高;在心臟缺血性疾病標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)Roquin-1的表達(dá)明顯增高。Roquin-1在缺血早期可抑制細(xì)胞凋亡從而緩解缺血進(jìn)展;在缺血晚期可抑制炎癥反應(yīng)并緩解器官重構(gòu)及失功。在肝臟IR過程中,Roquin-1的作用及機(jī)制尚未清楚。研究Roquin-1在肝臟IR中的作用對臨床診療工作具有重要意義。巨噬細(xì)胞(macrophage,m?)是肝臟IR中重要的天然免疫細(xì)胞。在肝臟IR早期便接受HMBG1等上游信號,向M1和/或M2極化,并分泌白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子等細(xì)胞因子,進(jìn)一步影響適應(yīng)性免疫。同時(shí),研究顯示Roquin-1缺乏可導(dǎo)致全身炎癥癥狀,肝臟內(nèi)m?浸潤增多;因TNF過表達(dá),對LPS導(dǎo)致的感染性休克更加敏感。那么,研究Roquin-1對m?的影響及機(jī)制則十分重要。基于以上內(nèi)容,本課題研究了Roquin-1調(diào)節(jié)m?免疫應(yīng)答并影響肝臟IR損傷的機(jī)制。1.Roquin-1對肝臟IR的影響為了探討Roquin-1對肝臟IR的影響,我們建立小鼠肝臟IR模型。通過PCR、WB和免疫組化(IHC)技術(shù)發(fā)現(xiàn),Roquin-1在IR后1小時(shí)表達(dá)增多,以后表達(dá)減少。同時(shí),免疫熒光雙標(biāo)提示Roquin-1主要在m?表達(dá)。進(jìn)一步,我們使用去除m?,并在肝臟IR 1小時(shí)前尾靜脈輸注干擾Roquin-1表達(dá)的m?,發(fā)現(xiàn)m?的Roquin-1干擾后肝臟IR損傷加重。另外,PCR及ELISA結(jié)果提示干擾Rqouin-1后,m?向M1極化增多、向M2極化減少。2.Roquin-1通過AMPK/m TOR/STAT3信號通路調(diào)節(jié)m?極化和功能體外研究部分,我們分離骨髓來源巨噬細(xì)胞(Bone marrow devired macrophage,BMDM)并誘導(dǎo)其向M1、M2的極化。結(jié)果顯示干擾Roquin-1可促進(jìn)m?向M1極化,抑制M2的極化。進(jìn)一步利用WB技術(shù)及AMPK和mTOR抑制劑,結(jié)果顯示Roquin-1通過抑制AMPKα磷酸化,促進(jìn)mTOR和STAT3的磷酸化。3.Roquin-1調(diào)控AMPKα泛素化及其活性為了研究AMPKα和泛素化的關(guān)系,我們在體外利用AICAR激活A(yù)MPKα,發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPKα后其自身泛素化水平下降。我們進(jìn)一步通過生物信息學(xué)對AMPK的潛在的泛素化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。通過體外點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了這些位點(diǎn)的泛素化受到Roquin-1的調(diào)節(jié)。同時(shí),通過WB檢測AMPKα的下游底物ACC1和Raptor的磷酸化,我們發(fā)現(xiàn)Roquin-1的干擾抑制了促進(jìn)了AMPKα的激活及其功能�？傊�,我們的研究結(jié)果表明,Roquin-1在肝臟IR的重要作用。首先,Roquin-1主要在m?表達(dá),并抑制m?向M1極化,促進(jìn)其向M2極化。進(jìn)一步,Roquin-1在m?中通過促進(jìn)泛素化抑制了AMPKα的活性,從而進(jìn)一步促進(jìn)了mTOR和STAT3的活性。本課題闡述了Roquin-1對肝臟IR損傷的保護(hù),并探討了其主要機(jī)制為通過泛素化調(diào)節(jié)AMPKα的活性并影響m?的極化和功能。為臨床對肝臟IR損傷的干預(yù)提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1.1 小鼠肝臟 HE、IHC、RT-qPCR、WB，血清 ALT、AST。小鼠肝臟 IR后，HE 及血清 ALT、AST 結(jié)果提示建模成功（A-B）;RT-qPCR、WB 和 IHC 結(jié)果提示 Roquin-1 在肝臟 IR 后 1h 表達(dá)增高，6、12h 表達(dá)降低，24h 有所恢復(fù)（。n=6）同時(shí)，為了明確 Roquin-1 在肝臟哪種細(xì)胞中顯著表達(dá)，我們使用了免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)（圖 1.2）。結(jié)果顯示 Roquin-1 主要在肝臟的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。

圖 1.1 小鼠肝臟 HE、IHC、RT-qPCR、WB，血清 ALT、AST。小鼠肝臟 IR后，HE 及血清 ALT、AST 結(jié)果提示建模成功（A-B）;RT-qPCR、WB 和 IHC 結(jié)果提示 Roquin-1 在肝臟 IR 后 1h 表達(dá)增高，6、12h 表達(dá)降低，24h 有所恢復(fù)（。n=6）同時(shí)，為了明確 Roquin-1 在肝臟哪種細(xì)胞中顯著表達(dá)，我們使用了免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)（圖 1.2）。結(jié)果顯示 Roquin-1 主要在肝臟的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文進(jìn)一步為了證實(shí)巨噬細(xì)胞在肝臟 IR 中的作用，我們利用 Liposomes 清除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，在肝臟 IR 前 1h 經(jīng)尾靜脈注干擾了 Roquin-1 表達(dá)的巨噬細(xì)胞。HE、 Suzuki’s 評分及血清 ALT、AST 結(jié)果顯示，注射干擾 Roquin-1 表達(dá)巨噬細(xì)胞的小鼠 IR 損傷較 WT 顯著加重（圖 1.3）。

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本文編號：2808594