腸易激綜合征(IBS)是一種功能紊亂性腸病,其癥狀主要表現(xiàn)為腹部疼痛或不適,伴有排便習慣或性狀改變,發(fā)病率高,因其反復發(fā)作的特點為患病人群帶來較大的生活負擔,但目前該病發(fā)病機制尚不明確,流行病學調查顯示,應激可造成IBS癥狀發(fā)作或加重。應激是生物機體在受到內外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)的全身性非特異性適應反應,又稱應激反應。而生命早期應激,如幼年期的精神創(chuàng)傷等早年負性生活事件,會增加成年后疾病的易感性,目前受到人們越來越多的關注。因此對早期應激損傷誘導的IBS的研究具有重要而獨特的作用,其機制可能涉及腦-腸軸的異常變化和神經免疫內分泌網絡中活性物質的異常等。近年來發(fā)現(xiàn)腸道菌群在腦-腸軸中扮演越來越重要的角色,菌群失調可能導致腸道內環(huán)境的紊亂和氨基酸等營養(yǎng)物質的代謝異常,而異常的氨基酸代謝可能導致體內活性代謝產物的異常,從而參與IBS的發(fā)病。其中,蛋氨酸在體內代謝循環(huán)中產生的一種活性物質,即同型半胱氨酸(Hcy),被公認為多種疾病的危險因子,其可能在IBS的發(fā)生發(fā)展中起到重要損傷作用,而其代謝途徑中產生的甲基基團可能參與IBS相關癥狀的表觀遺傳學機制。因此,本研究從"早年應激損傷——腸道菌群失調——氨基酸代謝改變——Hcy損傷作用”這個新的的研究思路出發(fā),揭示IBS的發(fā)病機制,并進一步探索Hcy介導的甲基化機制在IBS表觀遺傳學中的作用。這不僅對揭示IBS的發(fā)病機制,也對生物學診斷與治療提供新的啟示和科學依據,也對探索早年應激損傷誘導的其它疾病的生物學防治提供一定的啟示和科學思路。第一章早年應激致IBS大鼠腸道菌群和氨基酸代謝的變化目的:檢測早年應激致IBS大鼠腸道菌群和氨基酸代謝的改變,探討腸道菌群失調和氨基酸代謝異常在IBS相關癥狀中的作用及損傷機制。方法:(1)IBS動物模型建立及行為學評價:選用新生期大鼠母嬰分離(MS)的方式建立早年應激誘導的IBS疾病模型。采用行為學實驗來評價和確認腸易激綜合征動物模型的建立,包括結直腸擴張(CRD)-腹部回撤反射試驗檢測內臟敏感性、新異環(huán)境中排便性狀和數量檢測腸道轉運功能、曠場試驗和糖水偏嗜度試驗檢測精神行為改變,以及結腸組織HE染色。(2)腸道菌群的檢測和分析:使用糞便基因組DNA快速提取試劑盒提取大鼠糞便樣本中細菌基因組DNA,針對16S r DNA基因可變區(qū)域進行引物合成、擴增及測序,利用軟件進行糞便樣品的多樣性分析。(3)氨基酸的檢測:使用全自動氨基酸分析儀對各組大鼠糞便和血清樣本進行氨基酸濃度檢測。結果:(1)經過母嬰分離干預后,與正常對照組相比,可見MS大鼠CRD容量閾值下降(P0.05),提示內臟敏感性增強;MS大鼠排便數目增多(P0.05),提示腸道轉運功能增強;MS大鼠中央區(qū)停留時間減少(P0.05),提示焦慮樣行為更加明顯;MS大鼠糖水偏嗜度明顯降低(P0.05),提示抑郁樣行為增加;MS大鼠結腸HE病理染色未發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)學改變,與IBS病理特點一致。以上表明成功建立早年應激致IBS大鼠模型。(2)腸道菌群Alpha多樣性分析中,與正常對照組相比,IBS大鼠的Shannon指數下降,提示IBS大鼠的菌群多樣性下降。Beta多樣性指數中的Lef Se分析中,IBS大鼠腸道菌群中毛螺菌科、單形擬桿菌、克里斯滕森菌科、δ變形菌綱、脫硫弧菌目、脫硫弧菌科和脫硫弧菌屬的相對豐度均比正常對照組顯著升高。(3)氨基酸分析發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,IBS大鼠糞便中絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和賴氨酸均明顯升高;血清中蛋氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸顯著升高,而甘氨酸和賴氨酸則明顯下降。結論:(1)母嬰分離方式建立早年應激誘導的IBS大鼠疾病模型。(2)IBS大鼠腸道菌群多樣性降低,部分氨基酸代謝發(fā)生變化,它們可能共同參與了IBS的發(fā)病過程。其中蛋氨酸的顯著變化提示含硫氨基酸可能在IBS的發(fā)病機制中起到重要作用。第二章Hcy在早年應激所致IBS中的作用及對甲基化水平的影響目的:研究Hcy在早年應激所致IBS中的損傷作用,并檢測Hcy對甲基化水平的影響。方法:(1)Hcy在早年應激致IBS中的損傷作用:建立早年應激致IBS大鼠模型,實驗動物分組為C組、MS組、MS+Met組和MS+Vit組。使用高效液相色譜法檢測血漿Hcy水平。(2)Hcy對早年應激致IBS大鼠機體甲基化水平的影響:實驗動物分組為C組、MS組和MS+Vit組。使用ELISA法檢測大鼠血漿S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和結腸組織DNA總甲基化程度,使用Western blot法檢測DNMT1、DNMT 3a/3b的蛋白表達,使用實時熒光定量PCR法檢測DNMT1、DNMT3a/3b m RNA水平,使用ELISA法檢測DNMTs的總活性。結果:(1)血漿Hcy濃度檢測發(fā)現(xiàn),MS組比C組血漿Hcy濃度明顯升高(P0.05);MS+Met組和MS+Vit組分別在MS組的基礎上升高和降低了Hcy水平(P0.05),說明二者對Hcy水平具有相反方向的調控作用。行為學實驗結果顯示,MS+Met組比MS組的腸道癥狀和精神癥狀更加明顯,而MS+Vit組在MS組的基礎上緩解了上述癥狀(P0.05)。提示Hcy水平越高,IBS大鼠的的癥狀越明顯,Hcy可能是IBS的損傷因子。(2)與C組相比,MS組大鼠的血漿SAM水平顯著升高,SAH水平顯著降低,代表甲基化潛能的SAM/SAH比值則顯著升高;MS組大鼠結腸組織DNA總甲基化水平、結腸組織DNMT 3b的表達水平和DNMTs總活性明顯升高,DNMT1和DNMT 3a未見顯著性差異。經Vit B干預后,可緩解上述改變。結論:(1)Hcy可能是IBS的損傷因子,Hcy水平越高,IBS的癥狀越重。(2)Hcy水平變化引起了體內甲基化相關指標的變化,說明Hcy水平調控了體內的甲基化機制。第三章Hcy介導的甲基化機制調控IBS的分子基礎目的:探索Hcy介導的甲基化機制在IBS腸道屏障功能損傷中的分子基礎。方法:(1)Hcy對Claudin-1和Claudin-2表達的損傷效應:針對C組、MS組和MS+Vit組,使用實時熒光定量PCR和Western blot法分別對Claudin-1和Claudin-2以及Me CP2的m RNA水平和蛋白表達水平進行檢測,使用甲基化特異性PCR(MSP)技術分別檢測claudin-1和claudin-2基因啟動子甲基化水平。(2)Hcy介導的甲基化機制對Claudin-1和Claudin-2表達的影響:使用甲基轉移酶抑制劑地西他濱(Decitabine,Dac)降低MS組大鼠的甲基轉移酶總活性,針對C組、MS組和MS+Dac組,使用ELISA法檢測結腸組織DNA總甲基化程度,分別使用MSP技術、實時熒光定量PCR技術和Western blot法檢測claudin-1和claudin-2基因啟動子甲基化水平及其表達水平,并檢測Me CP2表達水平。結果:(1)與C組相比,MS組的claudin-1 m RNA水平和蛋白表達水平下降,基因啟動子甲基化水平升高;MS+Vit組則逆轉了此趨勢。與C組相比,MS組的claudin-2 m RNA水平和蛋白表達水平升高,基因啟動子甲基化水平降低;MS+Vit組則逆轉了此趨勢。Hcy水平越高,Me CP2表達越高。(2)與MS組相比,MS+Dac組總體DNA甲基化水平和甲基轉移酶總活性有所下降,claudin-1和claudin-2基因啟動子甲基化程度均有明顯下降,其相應的m RNA水平和蛋白表達水平均有明顯升高。DNA甲基化程度越高,Me CP2表達越高。說明甲基化機制在claudin-1和claudin-2基因啟動子甲基化程度及表達水平中起到調控作用。結論:(1)Claudin-1和Claudin-2是Hcy損傷效應的分子基礎,而Hcy介導的甲基化機制可能參與其調控。(2)Hcy介導的甲基化機制參與了對Claudin-1和Claudin-2表達調控。
【學位單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R574.4
【部分圖文】：

將 8Fr 兒童導尿管的頭端用石蠟油充分潤滑，輕輕向肛腸 5-8cm，并將導尿管尾端用醫(yī)用膠帶固定在鼠尾根窄的固定籠內，使其無法轉身。待大鼠清醒并適應籠溫生理鹽水經導尿管外口注入位于大鼠結直腸內的球加量，每次加量 0.4ml，直至最高 2.0ml，此過程中球觀察每次加量時大鼠腹部的反應及是否抬離接觸面，道缺血，每次持續(xù) 20 s 即可，重復測量 3 次，兩次之評分標準（圖 1-1)：腸擴張時無明顯行為學反應；腸擴張時頭部動作減少，身體無動作；腸擴張時腹肌略有收縮，但腹部未抬離接觸面；腸擴張時腹肌收縮強烈并抬離接觸面；腸擴張時腹部及骨盆抬起，身體呈現(xiàn)弓形。能夠引起 3 分腹部反應的最小注射容量閾值來評價內確、易于判斷、利于比較、結果穩(wěn)定、可靠性強等優(yōu)

圖 1-2 建庫流程圖，先對樣本濃度初步檢測，并將樣本稀釋至濃度 insert size，符合標準后使用熒光定量 PCR 儀和本 qPCR 試驗，再對文庫中的樣本的有效濃度庫采用 Miseq 測序，實施方案為 Illumina PE250析流程步的結果后，通過去除接頭污染、低質量堿基，再將分別從兩端測序所獲得的 Read1 與 Read。采用軟件 QIIME 1.8.0 版本分析拼接后的序、Alpha 多樣性分析和 Beta 多樣性分析等。序部分由北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司完成。

圖 1-4. Bristol 糞便性狀量表可用來評價結腸轉運功能，其多少反映了結腸遠顯示，在新異環(huán)境應激（曠場試驗箱）的過程中組大鼠糞便排出量明顯增多（3.12±0.39 vs. 1.87母嬰分離應激使大鼠在受到應激環(huán)境刺激（新異常，故此母嬰分離模型能夠模擬 IBS 的臨床特征C MS01234*fecaloutput(pelets)

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2808476