【摘要】：研究背景和目的：肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是指在慢性肝病和／或門脈高壓基礎(chǔ)上出現(xiàn)的肺內(nèi)血管異常擴(kuò)張,氣體交換障礙,動脈血氧合作用異常導(dǎo)致的低氧血癥及一系列病理生理變化與臨床表現(xiàn),通常包括肝硬化、動脈低氧血癥和肺內(nèi)血管擴(kuò)張三聯(lián)癥。肺內(nèi)毛細(xì)血管彌漫性擴(kuò)張是肝肺綜合征的基本病理改變,它的發(fā)生與擴(kuò)血管物質(zhì)一氧化氮(nitric oxide, NO)過度增加密切相關(guān)。 局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK), FAK含有6個可被磷酸化的酪氨酸位點(diǎn),即Tyr397、407、576、577、861和925,其中Tyr397是主要的自我磷酸化位點(diǎn)。外部因素(如整合素、生長因子、腫瘤壞死因子等)刺激誘導(dǎo)FAK在Tyr397位點(diǎn)自身磷酸化,由此為Src的SH2結(jié)構(gòu)域創(chuàng)建一個高親和力的結(jié)合位點(diǎn),形成FAK/Src信號復(fù)合物并激活,FAK激活后可通過一系列信號通路如FAK-Ras-MAPK、FAK-PI3K等信號通路引起各種生物學(xué)效應(yīng)。 10號染色體同源丟失性磷酸酶與張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)基因是一具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因,它不僅有脂質(zhì)磷酸酶活性,而且有蛋白磷酸酶活性。PTEN基因位于染色體10q23,其表達(dá)產(chǎn)物PTEN蛋白具有抑制細(xì)胞周期進(jìn)展、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞遷移、鋪展和局部黏附等生理功能。PTEN激活后通過其磷酸酶活性使P13K的脂類產(chǎn)物PIP3的D3位脫磷酸,進(jìn)而使PI3K功能喪失,從而阻斷PI3K/AKT信號通路。而PTEN表達(dá)的缺失或低表達(dá)則促進(jìn)PI3K的過表達(dá),進(jìn)而引起PI3K活性的釋放并激活A(yù)kt進(jìn)而引起各種生物學(xué)效應(yīng)。 大量的實驗證實腸細(xì)菌移位、腸內(nèi)毒素血癥、肺單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的激活在HPS的發(fā)病原理中也許發(fā)揮重要作用。肝臟內(nèi)毒素清除的機(jī)能失調(diào),并且由于存在門體靜脈分流,最終導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素誘導(dǎo)和激活體內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞系統(tǒng),包括肝臟Kupffer細(xì)胞,脾臟巨噬細(xì)胞,肺血管巨噬細(xì)胞(PIMs)和血單核細(xì)胞。由于肝臟解毒減少,肺代償性清除細(xì)菌和毒素。隨后,血液單核細(xì)胞在肺血管內(nèi)皮積累,然后分化為肺血管巨噬細(xì)胞(PIMs).PIMs吞噬作用的功能是增加血中細(xì)菌和毒素的清除。清除血液的體內(nèi)異物之后,肺血管巨噬細(xì)胞(PIMs)被激活并分泌各種活化物質(zhì)如NO, TNF-a, CO, IL-1, IL-6, IL-8和其他炎性介質(zhì)。其中,TNF-α是具有代表性的炎性介質(zhì),它能誘導(dǎo)局部釋放單核細(xì)胞趨化因子,并可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)粘附因子,進(jìn)一步加劇了肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞大量聚集與粘附。TNF-a能激活FAK及使PTEN表達(dá)減少,激活的FAK和表達(dá)減少的PTEN通過PI3K/Akt信號通路進(jìn)一步作用于NF-κB,而NF-κB參與了包括iNOS和‘TNF-α在內(nèi)的眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。這樣導(dǎo)致了：一方面,巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS過度表達(dá),導(dǎo)致了NO過度生成；而另一方面,新生成的TNF-a又能進(jìn)一步加強(qiáng)NF-κB的作用,從而形成級聯(lián)正反饋,最終使NO過度生成,導(dǎo)致HPS的發(fā)生。 HPS在肝硬化患者中的發(fā)生率約為15%-30%,其增加肝硬化患者的死亡率,預(yù)后極差。目前由于HPS的發(fā)病機(jī)理仍然不明,因此藥物治療的效果并不滿意。肝移植是目前唯一能夠有效的治療與逆轉(zhuǎn)HPS的方法。所以,研究肝肺綜合征的發(fā)病機(jī)理,尋求有效的治療方法至關(guān)重要。 我們前期應(yīng)用膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation, CBDL)致大鼠肝肺綜合征模型的實驗結(jié)果說明手術(shù)模型組大鼠血漿TNF-a水平、動脈血?dú)釶(A-a)O2、NO水平較假手術(shù)組均明顯升高,而應(yīng)用TNF-a McAb治療的大鼠的TNF-a等水平較同周的手術(shù)模型組均明顯降低(有統(tǒng)計學(xué)意義),并發(fā)現(xiàn)應(yīng)用TNF-a McAb治療的大鼠的肝臟在組織學(xué)和生化指標(biāo)上都有明顯改善。我們的前期實驗還證實了TNF-a是通過PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)其對下游因子的作用參與了HPS形成。FAK與PTEN是PI3K信號通路上游的因子,TNF-a可以激活FAK和可以使PTEN表達(dá)減少,因此,我們考慮TNF-a激活FAK、使PTEN表達(dá)減少,活化的FAK與表達(dá)減少的PTEN隨之引起PI3K信號通路的改變可能參與了HPS形成。為此,我們采用TNF-a McAb治療CBDL所致的HPS大鼠,觀察TNF-a McAb干預(yù)治療后對FAK、p-FAK. PTEN表達(dá)的影響。 方法：應(yīng)用CBDL致大鼠肝肺綜合征的模型。把60只雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)地分為假手術(shù)組(sham組)、CBDL組(分為CBDL1周、2周、3周、4周、5周組五個亞組)及CBDL+TNF-αMcAb干預(yù)組(CBDL+TNF-αMcAb,分為膽總管結(jié)扎1周后TNF-αMcAb干預(yù)治療1周、2周、3周、4周組四個亞組),共10個亞組,每組各6只大鼠。干預(yù)治療組于術(shù)后1周開始給與腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(TNF-αMcAb(0.1g/kg/2d),而CBDL組大鼠對應(yīng)的注射相當(dāng)劑量的生理鹽水,各組動物均在規(guī)定時間點(diǎn)取材(sham組與CBDL組第五周大鼠同時取材),應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測FAK和p-FAK在肺組織中的表達(dá)定位與表達(dá)程度；采用Western blot方法檢測FAK、p-FAK和PTEN在肺組織中的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1免疫組織化學(xué)法檢測肺組織FAK和p-FAK的表達(dá) 1.1肺組織FAK表達(dá)①CBDL組：大鼠肺組織內(nèi)FAK蛋白的陽性表達(dá)較多,可見細(xì)胞胞漿呈棕褐色細(xì)顆粒,陽性表達(dá)多集中在肺內(nèi)巨噬細(xì)胞胞漿中,于三周時達(dá)高峰(0.095±0.011),此后,CBDL組在四周時下降,五周時又見回升,表達(dá)均高于sham組(0.040±±0.005),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05).②TNF-αMcAb組：干預(yù)治療一周(0.058±0.003)后,與CBDL相比,FAK蛋白表達(dá)即被明顯抑制(P0.05),此后,在各時間點(diǎn)FAK的陽性表達(dá)均比同時間點(diǎn)的CBDL組弱,基本維持在上述的水平,但是仍明顯高于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 1.2肺組織p-FAK表達(dá)p-FAK蛋白的陽性反應(yīng)為黃色顆粒,主要定位在肺巨噬細(xì)胞的胞漿。①CBDL組p-FAK蛋白陽性表達(dá)在術(shù)后三周達(dá)峰值(0.087±0.004),四周時下降,五周時又有所回升,與sham組(0.034±0.002)相比,陽性細(xì)胞數(shù)目和表達(dá)強(qiáng)度均較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。②TNF-αMcAb干預(yù)治療組：各時間點(diǎn)的p-FAK蛋白的陽性表達(dá)較CBDL組均有明顯的減少,至治療的第四周(0.035±±0.005)明顯低于同周CBDL組(0.084±0.009),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),干預(yù)治療組4周時p-FAK蛋白的陽性表達(dá)雖高于sham組,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2 Western Blot方法檢測肺組織FAK、p-FAK和PTEN的表達(dá) 2.1 Western Blot分析FAK①CBDL組FAK蛋白表達(dá)呈逐漸上升的趨勢,于術(shù)后第三周達(dá)一個高峰值(1.01±0.10),此后呈下降趨勢,均高于sham(0.27±0.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。②TNF-αMcAb組治療1周(0.44±0.04)后與同時間的CBDL組相比較,即被明顯的抑制,后三周干預(yù)治療組亦低于CBDL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),干預(yù)治療組均高于sham組,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.2 Western Blot分析p-FAK:(DCBDL組p-FAK蛋白表達(dá)于術(shù)后第三周達(dá)一個高峰值(0.55±0.05),此后呈下降趨勢,均高于sham組(0.10±0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);②TNF-αMcAb組治療1周(0.18±±0.01)后與同時間的CBDL組相比較,即被抑制。后三周干預(yù)治療組均明顯低于CBDL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),干預(yù)治療組均高于sham組,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.3 Western Blot分析p-FAK/FAK:p-FAK/FAK在CBDL組呈逐漸上升的趨勢,至第四周時達(dá)到高峰(0.72±±0.05),與sham組比較有明顯差異(P0.05).TNF-αMcAb干預(yù)治療組與CBDL組的p-FAK/FAK整體變化趨勢基本一致,各個時間點(diǎn)整體均較同周CBDL組的值低,且有明顯的差異(P0.05),而第一周(0.40±±0.04)、第四周(0.42±±0.03)與sham組(0.38±±0.06)比較無明顯差異(P0.05)。 2.4 Western Blot分析PTEN:①CBDL組PTEN蛋白表達(dá)呈下降的趨勢,于術(shù)后第2周最低(0.52±±0.03),3周時升高,此后又有所下降,均低于sham組(1.01±±0.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05).②TNF-αMcAb組治療1周(0.62±±0.02)后與同時間的CBDL組相比較,即明顯的升高,后三周干預(yù)治療組亦高于CBDL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),干預(yù)治療組與sham組比較,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1 HPS的發(fā)生過程中伴隨著PTEN表達(dá)的明顯降低,存在PTEN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變,說明PTEN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了HPS發(fā)生 2 HPS的發(fā)生過程中伴隨著FAK表達(dá)的明顯增加,p-FAK水平增多,存在FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,說明FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了HPS發(fā)生 3 TNF-a McAb對HPS的治療可能是通過FAK、PTEN等信號分子發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575;R563

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本文編號：2774404