【摘要】：[背景及目的] 終末期肝病(end stage liver disease, ESLD)是急、慢性肝病的終末階段,常伴有肝衰竭的臨床表現(xiàn)。傳統(tǒng)治療終末期肝病的方法有限,且死亡率高。肝移植(Liver transplantation)是目前最有效的治療方法,但存在供體肝缺乏、移植后免疫排斥反應(yīng)及高額治療費用等問題而難以普遍開展,而干細胞移植是目前治療終末期肝病的一種可能有效的治療方法。 干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞。已有體外研究證實骨髓來源的干細胞在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為肝臟細胞。移植了男性骨髓的女性白血病患者,其肝臟活檢組織中亦發(fā)現(xiàn)有Y染色體陽性的肝細胞,提示骨髓來源的干細胞具有分化為肝細胞,參與肝臟修復(fù)的功能。骨髓來源細胞(bone marrow derived cells,BMDCs)中主要包含兩種類型的干細胞,即造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSC)和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)。但BMDCs是如何參與肝臟損傷修復(fù)的及其可能的機制目前并不十分清楚。 基于以上分析,本實驗擬首先構(gòu)建骨髓嵌合型小鼠模型,并采用四氯化碳(CCl4)致骨髓嵌合型小鼠肝損傷,采用FISH+免疫熒光雙標(biāo)記的方法,通過激光共聚焦顯微鏡觀察在肝損傷后不同時相點,BMDCs在肝臟的歸巢、分化及與原位干細胞融合的情況,并對干細胞相關(guān)因子SDF-1、CXCR4、HGF、SCF進行檢測,以明確BMDCs在肝臟損傷后修復(fù)中的作用及其可能機制。進一步結(jié)合本課題組其他人員的工作基礎(chǔ),系統(tǒng)研究了microRNA(miRNA)通過對SDF-1的調(diào)控作用影響干細胞的趨化及組織修復(fù)能力,為干細胞治療終末期肝病的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 [方法] 1、分離C57BL/6小鼠骨髓干細胞(BMDCs),并經(jīng)尾靜脈移植給到致死劑量(10Gy)照射的同種屬異性的C57BL/6小鼠,重建其骨髓造血系統(tǒng),以建立穩(wěn)定的骨髓嵌合型小鼠模型。 2、采用CCl4腹腔注射至骨髓嵌合型小鼠,構(gòu)建急性肝損傷模型。 3、10Gy照射C57BL/6雌性小鼠后,移植其同種屬雄性小鼠的BMDCs或MSCs。21d后,受體鼠經(jīng)CCl4致急性肝損傷,肝損傷后第2、3、4、7、14、21、28d分別取其肝臟標(biāo)本,部分標(biāo)本制成冰凍切片,行Y染色體原位雜交檢測(FISH)與肝白蛋白(ALB)免疫熒光染色的雙標(biāo)記實驗,于激光共聚焦顯微鏡下觀察BMDCs的趨化與轉(zhuǎn)分化情況;部分標(biāo)本做勻漿處理后,通過ELISA方法檢測損傷肝臟組織中SDF-1、CXCR4、HGF、SCF的表達情況。 4、10Gy照射C57BL/6雄性小鼠后,移植其同種屬雌性綠色熒光(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的BMDCs。21d后使用CCl4致受體鼠肝損傷,分別取肝損傷后第14、21d肝臟標(biāo)本制成肝凍切片,行Y-FISH與GFP蛋白免疫熒光染色的雙標(biāo)記試驗,于激光共聚焦顯微鏡下觀察BMDCs的趨化與融合情況。 5、分離雄性C57BL/6小鼠BMDCs,將細胞平均分成兩等份,其中一份加入SDF-1抑制劑(17-AAG),于37℃下孵育30min;另一份不加入SDF-1抑制劑。將10Gy照射的C57BL/6雌性受體小鼠分為兩組,一組移植加入抑制劑的BMDCs,另一組移植未加入抑制劑的BMDCs。21d后使用CCl4致受體鼠肝損傷,取肝損傷后21d肝臟,制成肝臟冰凍切片,進行Y染色體原位雜交檢測(FISH)與肝白蛋白(ALB)的免疫熒光染色雙標(biāo)記,于激光共聚焦顯微鏡下觀察SDF-1對BMDCs的趨化情況。 6、通過real-time PCR技術(shù)檢測正常肝組織及肝損傷后21天的肝組織中相關(guān)miRNA的含量變化。進一步使用雙熒光素酶實驗、Western blot以及點突變實驗對SDF-1具有調(diào)控作用的相關(guān)miRNA進行鑒定。 7、采用Transwell穿膜實驗對SDF-1調(diào)控相關(guān)miRNA進行功能分析,觀察SDF-1調(diào)控相關(guān)miRNA在體外對間充質(zhì)干細胞趨化能力的影響。 [結(jié)果] 1、分離了C57BL/6的BMDCs,并將其移植給經(jīng)10Gy照射后的同種屬異性別的受體鼠,成功構(gòu)建了穩(wěn)定的C57BL/6骨髓嵌合小鼠模型。 2、使用濃度為0.3%的CCl4油劑造成受體鼠急性肝損傷,肝細胞出現(xiàn)大片的變性、壞死,成功構(gòu)建了CCl4致肝臟急性損傷的小鼠模型。 3、通過使用FISH+免疫熒光雙標(biāo)記的方法,激光共聚焦顯微鏡下在肝臟冰凍切片中可以觀察到二者的共表達。其中,BMDCs及MSC在肝細胞分化實驗中的共表達比率分別在3.37%-5.85%與1.54-2.96%之間;而BMDCs在肝細胞融合實驗中共表達的比率為0.32-0.87%。 4、ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)SDF-1與CXCR4在肝損傷后的各時相點均有不同程度的增高,在損傷后第21d出現(xiàn)高峰表達。對比SDF-1抑制劑使用組與未使用組,SDF-1抑制劑對BMDCs的趨化及轉(zhuǎn)分化具有明顯的抑制效應(yīng)。 5、ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子(HGF)及干細胞因子(SCF)的檢測亦在肝損傷后各時相點有不同程度的增高,并同時在損傷后第21d出現(xiàn)高峰表達。 6、通過real-time PCR技術(shù)、雙熒光素酶實驗、Western blot、點突變實驗證實miR-27b可以通過SDF-1的3’UTR影響SDF-1的轉(zhuǎn)錄后翻譯,從而下調(diào)SDF-1蛋白的表達,進一步采用Transwell穿膜實驗證實miR-27可以通過下調(diào)SDF-1的表達減少MSCs的趨化作用。 [結(jié)論] 1、BMDCs與MSC可以轉(zhuǎn)分化為具有分泌白蛋白活性的肝樣細胞,同時BMDCs亦可以與原位肝細胞發(fā)生融合。但是,由于分化的比率明顯高于細胞融合比率,因此推測在BMDCs參與肝損傷修復(fù)的直接作用中,干細胞直接分化為肝樣細胞是其主要的修復(fù)機制。 2、SDF-1/CXCR4軸在肝損傷后BMDCs趨化、歸巢及轉(zhuǎn)分化過程中具有重要作用。 3、HGF、SCF在BMDCs移植后明顯增高,提示在BMDCs參與肝損傷修復(fù)的間接作用中,由于HGF、SCF等細胞因子的分泌所導(dǎo)致的局部微環(huán)境的改變,亦有可能促進肝臟原位干細胞的增殖及分化,參與受損肝臟的修復(fù)。 4、miR-27b可以通過SDF-1的3’UTR影響SDF-1蛋白的表達,進而影響干細胞向受損肝臟的趨化,從而影響干細胞參與肝臟修復(fù)的能力。綜合以上結(jié)論,本研究提出了miR-27b通過調(diào)控SDF-1的表達,影響干細胞參與肝臟修復(fù)的途徑如下:
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.3
【圖文】：

在受體雌性鼠經(jīng)過致死劑量放射線照射后，通過接受雄性供體鼠骨髓移植后，其染色體核型由XX型，轉(zhuǎn)化為XY型，即供體鼠的骨髓細胞已經(jīng)將其造血系統(tǒng)重建，并使其發(fā)生核型轉(zhuǎn)化，使之成為骨髓嵌合型小鼠(圖1)。

但以 0.3%劑量濃度的效果最為顯著，表現(xiàn)為肝細胞大片變性、壞死，在匯管區(qū)有大片的肝細胞壞死。故實驗中選取此濃度為實驗標(biāo)準(zhǔn)濃度。圖2 受損肝臟HE染色：濃度分別0.3%、0.6%、0.8%、1%的CCl4油劑懸浮溶液，均可以使肝細胞出現(xiàn)變性、壞死，但以0.3%劑量濃度的效果最為顯著，表現(xiàn)為肝細胞大片變性、壞死，其匯管區(qū)尤為明顯。

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果可共表達于同一細胞內(nèi)(圖 3)，提示骨髓來源細胞可以轉(zhuǎn)分，參與受損肝臟的修復(fù)。通過在激光共聚焦顯微鏡下對不同時隨機連續(xù)拍照 10 次，分別通過不同的人員在屏幕上行人工計的細胞數(shù)量為 13.96%-18.13%，而 Y 染色體和 ALB 雙陽性的5% (圖 4)。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姚鵬;胡大榮;王帥;聞煒;周一鳴;龔麗娟;;人自體骨髓干細胞移植治療慢性肝功能衰竭的研究[J];中華肝臟病雜志;2005年12期

本文編號：2758059