【摘要】：目的：HBV感染是影響人類(lèi)健康的重要疾病之一,全球約有3.5億HBV慢性攜帶者,其中大量患者肝臟病變呈慢性化趨勢(shì)。由于HBV并不直接致肝細(xì)胞病變,目前認(rèn)為肝組織損傷主要是HBV感染后機(jī)體免疫應(yīng)答異常的結(jié)果,特異性和非特異性炎性細(xì)胞在肝組織內(nèi)的浸潤(rùn)起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子分泌異常與HBV感染后肝臟炎癥的慢性化及肝細(xì)胞的損傷存在密切關(guān)系。然而,到底何種細(xì)胞因子招募炎性細(xì)胞到達(dá)HBV感染后的肝臟目前尚不清楚。本研究擬在動(dòng)物模型體內(nèi)探討HBV感染對(duì)趨化因子Mig表達(dá)的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制,并研究Mig在肝臟炎性細(xì)胞招募和肝組織損傷中所發(fā)揮的作用。 方法：構(gòu)建HBV全基因組腺病毒載體,感染3種肝源性細(xì)胞株：人胎肝細(xì)胞株L02、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721及HepG2,定量PCR及ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV DNA拷貝數(shù)及HBsAg、HBeAg的表達(dá)量,RT-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HBx的表達(dá),證實(shí)該病毒感染體外培養(yǎng)的肝源性細(xì)胞株的能力。HBV小鼠模型的建立,將90只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組,分別通過(guò)尾靜脈注射將表達(dá)HBV全基因組的腺病毒載體(Ad-HBV)、腺病毒空載體(Adenovirus)或生理鹽水(Control)注入到小鼠體內(nèi)；采用ECLIA及ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物模型體內(nèi)HBsAg、趨化因子Mig的分泌及小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度,原位雜交檢測(cè)肝組織中Mig RNA的表達(dá)；定量PCR檢測(cè)HBVDNA和cccDNA拷貝數(shù)；應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)肝組織中NF-κB p50和p65亞基的表達(dá),免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-κBp50和p65亞基在肝細(xì)胞內(nèi)的分布,觀察NF-κB抑制劑MG-132對(duì)HBV誘導(dǎo)Mig分泌的影響；同時(shí),Western blot檢測(cè)Ad-HBV對(duì)NF-κB相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白p38、ERK1/2、JNK、PI3K磷酸化的影響；利用HE染色觀察肝臟炎性灶大小、數(shù)量；流式細(xì)胞技術(shù)分析各種炎性細(xì)胞在小鼠肝組織的比例。設(shè)計(jì)合成Mig-siRNA, RT-PCR及ELISA檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞株中Mig表達(dá)的變化。根據(jù)Mig-siRNA檢測(cè)結(jié)果,構(gòu)建Mig mRNA的干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒,酶切及測(cè)序鑒定重組體。重組體與去唾液酸蛋白形成去唾液酸-聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物后,通過(guò)尾靜脈注射法注入HBV小鼠模型體內(nèi),ELISA檢測(cè)上述干預(yù)后小鼠血清中Mig的表達(dá)及病毒抗原HBsAg、HBeAg的含量,定量PCR檢測(cè)HBV DNA和cccDNA拷貝數(shù),測(cè)定上述干預(yù)后小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度,HE染色觀察肝臟炎性灶大小、數(shù)量的變化,流式細(xì)胞術(shù)分析上述干預(yù)后各種炎性細(xì)胞在肝臟中的比例。 結(jié)果：酶切鑒定結(jié)果證明1.3拷貝HBV全基因組腺病毒載體構(gòu)建成功,經(jīng)包裝、收毒、擴(kuò)增后獲得物理滴度為6.138x1012VP/ml、精確滴度為2.5x1011PFU/ml的Ad-HBV病毒顆粒。Ad-HBV具有感染體外培養(yǎng)細(xì)胞株的能力(L02、SMMC-7721、HepG2),三種受感染的細(xì)胞均表達(dá)HBx,培養(yǎng)上清中均可檢測(cè)到HBsAg、HBeAg及HBV DNA。與腺病毒空載體組及生理鹽水組相比較,Ad-HBV感染BALB/c小鼠后在小鼠血清中可檢測(cè)到HBsAg、HBeAg (p0.05)、HBV DNA、cccDNA并且ALT濃度明顯增高p0.01)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),HBeAg及HBV DNA逐漸降低,血清中開(kāi)始出現(xiàn)抗HBs和HBe抗體,其表達(dá)量隨時(shí)間而增加。ELISA及原位雜交方法檢測(cè)結(jié)果顯示Ad-HBV感染后小鼠血清中趨化因子Mig表達(dá)顯著增加p0.05),并且Mig主要在肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)。免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-HBV感染后小鼠肝組織中NF-κB信號(hào)通路被激活,其亞基p50、p65從胞漿向胞核轉(zhuǎn)位；NF-κB抑制劑MG-132可有效抑制NF-κB的激活,并阻斷Ad-HBV誘導(dǎo)的趨化因子Mig分泌(427.64±110.1)(P0.01)。此外,通過(guò)Western blot檢測(cè)我們還發(fā)現(xiàn)Ad-HBV感染后肝組織中NF-κB上游信號(hào)通路PI3K/Akt、JNK、ERK1/2信號(hào)通路被激活。Akt、JNK、ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著增加,而Ad-HBV并未引起p38蛋白磷酸化水平的顯著變化。HE染色結(jié)果顯示Ad-HBV感染后小鼠肝臟炎癥灶形成,表現(xiàn)為以門(mén)管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥,流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加,主要以CD4+、CD8+、NK及NKT細(xì)胞為主。設(shè)計(jì)Mig-siRNA轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞株,Mig表達(dá)顯著下降,篩選出抑制率最高的siRNA2成功構(gòu)建Mig-shRNA重組體,與去唾液酸蛋白結(jié)合形成復(fù)合體后注射入小鼠體內(nèi)可部分抑制小鼠體內(nèi)Mig的表達(dá)(551.4±65.7)p0.01),同時(shí)抑制肝臟炎性細(xì)胞的招募(P0.05),降低ALT濃度(第7日：148.0±17.0,第14日：100.3±25.9)(p0.01),減輕肝組織損傷。然而,Mig表達(dá)的抑制對(duì)病毒抗原HBsAg、HBeAg的含量、HBV DNA及cccDNA拷貝數(shù)無(wú)顯著影響。 結(jié)論：腺病毒能有效地將HBV基因組導(dǎo)入小鼠肝細(xì)胞,HBV通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)趨化因子Mig表達(dá),從而招募炎性細(xì)胞在肝臟聚集導(dǎo)致肝損傷,這有助于進(jìn)一步闡明乙型病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制,為其免疫調(diào)節(jié)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 梁蔚芳;劉志華;駱抗先;;重組腺病毒介導(dǎo)的1.2拷貝HBV DNA在3種肝細(xì)胞中的表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年04期

本文編號(hào)：2753583