【摘要】：目的結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)已經(jīng)成為第三常見的惡性腫瘤及癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。研究表明隨著炎癥性腸病患者病史的延長,CRC患病率明顯升高,即結(jié)腸炎相關(guān)腸癌(colitis-associated cancer,CAC)。除腸道炎癥外,參與CAC發(fā)病的因素還包括免疫反應(yīng)、表觀遺傳學(xué)的改變及腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)促進多種腸道疾病的發(fā)生,同時也影響膽汁酸代謝。膽汁酸在腸道菌群作用下發(fā)生去結(jié)合、氧化、7α-脫羥基化、酯化和脫硫等代謝過程,并參與維持膽固醇代謝、營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收以及機體代謝穩(wěn)態(tài)。膽汁酸還可以激活膽汁酸受體法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)及G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體-1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5),FXR及TGR5具有調(diào)節(jié)腸粘膜屏障、腸道炎癥及菌群組成的作用。本研究構(gòu)建CAC模型,旨在探索腸道菌群失調(diào)與膽汁酸代謝紊亂在腸道腫瘤進展中的作用,為腸道腫瘤的治療提供新的思路。方法SPF級7周齡雌性C57BL/6小鼠20只,隨機分為對照組和炎癌組。適應(yīng)環(huán)境1周后,第0周留取兩組小鼠的糞便用于菌群檢測。實驗第1天,炎癌組于腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),對照組腹腔注射0.9%生理鹽水作為對照。分別于實驗第8-12天、27-31天及46-50天給予炎癌組5天1.5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)飲用水,每次DSS飲水后給予2周無菌飲用水,對照組始終給予無菌飲用水。每天密切觀察小鼠飲食飲水、排便及一般情況,每周末記錄小鼠體重。第10周末,收集小鼠糞便后處死小鼠。量取結(jié)腸長度,并記錄脾重�？v行剖開腸段后,于解剖顯微鏡下觀察腸道腫瘤分布、數(shù)量及大小情況。留取部分結(jié)腸,保存于10%福爾馬林溶液中以備石蠟包埋。將結(jié)腸及小腸組織凍存于-80℃冰箱,用于后續(xù)實驗。(1)蠟塊組織切片后,進行HE染色評估腸道炎癥情況及腸道腫瘤癌變程度。(2)Realtime-PCR方法檢測小鼠結(jié)腸組織炎性細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達情況。(3)采用Realtime-PCR方法檢測結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin1及Claudin3的mRNA水平。(4)采用16S rRNA高通量測序方法檢測兩組小鼠第0周及第10周末糞便菌群的組成。對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控后,將相似度達97%的Reads進行聚類獲得操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs)。與16S數(shù)據(jù)庫對比,對每個OTU進行物種分類。運用QIIME統(tǒng)計方法對炎癌組及對照組進行Alpha多樣性及Beta多樣性分析。(5)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測糞便膽汁酸水平。樣本經(jīng)預(yù)處理后,根據(jù)質(zhì)譜儀分析結(jié)果繪制標準曲線,通過曲線峰面積計算出每個樣本膽酸、鵝去氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸及鼠膽酸的濃度。(6)采用Realtime-PCR方法檢測小鼠回腸末端組織FXR、成纖維細胞生長因子15(fibroblast growth factor 15,FGF15)及膽汁酸轉(zhuǎn)運載體頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運體(apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT)、有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體(organic solute transporter alpha-beta,OSTα-OSTβ)的mRNA水平。Realtime-PCR及免疫組化方法檢測結(jié)腸組織TGR5的表達水平。結(jié)果炎癌組小鼠給予DSS飲水期間體重下降明顯且觀察到血便,結(jié)腸可見多個腫瘤。對照組未觀察到便中有血及腫瘤形成。AOM/DSS處理后小鼠結(jié)腸出現(xiàn)嚴重炎癥反應(yīng),且腸粘膜屏障受到破壞,表現(xiàn)為炎性細胞因子表達增多,緊密連接蛋白表達減少。與對照組相比,炎癌組菌群物種多樣性及豐度減少,門水平Bacteroidetes豐度下降,Firmicutes升高;屬水平上,炎癌組致病菌螺桿菌屬及鏈球菌屬表達增多,產(chǎn)短鏈脂肪酸菌Lachnospiracea_incertae_sedis、Alistipes及Odoribacter表達下降,表明CAC發(fā)展過程中有益菌減少,致病菌表達增多。此外,炎癌組參與膽汁酸代謝的梭菌亞群XlV及乳酸菌屬表達下降,表明炎癌組膽汁酸去結(jié)合、轉(zhuǎn)化及脫硫能力下降,表現(xiàn)為糞便中游離膽汁酸水平下降,初級膽汁酸向次級膽汁酸轉(zhuǎn)化的能力降低。CAC模型中FXR-FGF15信號軸下調(diào),結(jié)腸腫瘤部位TGR5的表達增多。結(jié)論CAC發(fā)展過程中,腸道菌群失調(diào)影響膽汁酸的代謝與組成,導(dǎo)致具有抗炎作用的次級膽汁酸表達減少,在膽汁酸受體的共同作用下促進腸道腫瘤進展。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.3;R574.62
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果/DSS 模型小鼠腸道腫瘤形成情況一般狀態(tài)及排便情況察兩組小鼠的飲食飲水、排便及一般情況，對照組小鼠長狀態(tài)佳，進食飲水良好，排便正常，糞便中未見便中SS 組）有 2 只小鼠在 DSS 飲水第二個循環(huán)中因癥狀嚴 DSS 飲水后，小鼠的體重呈現(xiàn)下降趨勢，觀察小鼠糞便現(xiàn)血便。對照組與 AOM/DSS 組小鼠體重在實驗開始時5±0.23g，P＞0.05），差別無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗期間每周進行記錄，對照組體重呈現(xiàn)平穩(wěn)持續(xù)上升，而 AOM/DSS循環(huán)中可見明顯的體重下降，見圖 1。

圖 2 兩組小鼠腸道腫瘤形成情況（A：對照組與 AOM/DSS 組結(jié)腸長度與脾臟重量；B：對照組與 AOM/DSS 組結(jié)腸腔內(nèi)大體表現(xiàn)，AOM/DSS 組結(jié)腸腫瘤的數(shù)量與大小。**，P＜0.01）2.2 結(jié)腸炎相關(guān)腸癌腸道炎癥情況2.2.1 結(jié)腸病理學(xué)特征對照組結(jié)腸無腫瘤形成，AOM/DSS 組 HE 染色結(jié)果顯示結(jié)腸腫瘤及腫瘤旁部位較對照組可見明顯炎性細胞浸潤，病理表現(xiàn)為粘膜內(nèi)癌伴中-高級別上皮內(nèi)瘤變，見圖 3。2.2.2 腸道炎癥細胞因子的表達Realtime-PCR 檢測兩組結(jié)腸炎癥情況。結(jié)果顯示：AOM/DSS 組較對照組相比，炎性細胞因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 表達水平明顯升高，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。表明結(jié)腸炎相關(guān)腸癌結(jié)腸產(chǎn)生明顯炎癥反應(yīng)，見圖 3。

圖 2 兩組小鼠腸道腫瘤形成情況（A：對照組與 AOM/DSS 組結(jié)腸長度與脾臟重量；B：對照組與 AOM/DSS 組結(jié)腸腔內(nèi)大體表現(xiàn)，AOM/DSS 組結(jié)腸腫瘤的數(shù)量與大小。**，P＜0.01）2.2 結(jié)腸炎相關(guān)腸癌腸道炎癥情況2.2.1 結(jié)腸病理學(xué)特征對照組結(jié)腸無腫瘤形成，AOM/DSS 組 HE 染色結(jié)果顯示結(jié)腸腫瘤及腫瘤旁部位較對照組可見明顯炎性細胞浸潤，病理表現(xiàn)為粘膜內(nèi)癌伴中-高級別上皮內(nèi)瘤變，見圖 3。2.2.2 腸道炎癥細胞因子的表達Realtime-PCR 檢測兩組結(jié)腸炎癥情況。結(jié)果顯示：AOM/DSS 組較對照組相比，炎性細胞因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 表達水平明顯升高，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。表明結(jié)腸炎相關(guān)腸癌結(jié)腸產(chǎn)生明顯炎癥反應(yīng)，見圖 3。

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2 肖夢宇;;膽汁酸代謝及相關(guān)核受體研究進展[J];中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生;2014年03期

3 魯旭;韓濤;田W

本文編號：2748309