發(fā)布時間：2020-07-05 21:00

【摘要】：背景原發(fā)性肝癌是全球最常見的癌癥,乙型肝炎病毒是其主要的病因。一項基于亞太與北美的研究提示,慢性HBV感染發(fā)生原發(fā)性肝細胞癌的機會是普通人群的25-37倍。但乙型肝炎患者高發(fā)肝癌的確切機制并不清楚。近年來新的研究證實微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,尤其是微環(huán)境中細胞免疫對腫瘤的發(fā)生起著更為關(guān)鍵的作用。Prendergast GC等人提出“癌癥是一種微環(huán)境和免疫疾病”這一重要概念。針對這一概念,有關(guān)學(xué)者也進行了大量探討,研究主要集中在Th1細胞與Th2細胞失衡、NK細胞、Treg淋巴細胞、Th17細胞、巨噬細胞等。但評價肝細胞癌患者細胞免疫的整體狀況研究相對少見。T細胞受體互補決定區(qū)3譜型分析技術(shù)是一項很好的反映機體細胞免疫功能的新方法。本研究采用該技術(shù)分析乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者的局部與整體細胞免疫功能情況,并探討局部細胞免疫在肝細胞癌發(fā)病機制中的作用。目的采用T細胞受體譜型分析技術(shù)對乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫癌組織中T淋巴細胞的TCR CDR3譜型特征進行分析,探討肝細胞癌患者整體細胞免疫與肝癌局部細胞免疫之間的差異,從而了解局部細胞免疫在肝細胞癌發(fā)病機制中的作用,為肝細胞癌免疫治療提供新的理論依據(jù)和客觀的評價方法。方法(1)收錄新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院2015年3月-8月手術(shù)切除的乙肝相關(guān)肝細胞癌患者10例,術(shù)前收集肝素化的外周血10-20ml。并于術(shù)后收集配對的非腫瘤肝組織與腫瘤組織.⑵RNA提取、c DNA合成以及PCR擴增:使用總RNA提取試劑盒提取外周血、非腫瘤肝組織以及腫瘤組織總RNA,并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成c DNA。根據(jù)文獻設(shè)計合成TCRBV 24個家族上游引物,并在B鏈恒定基因區(qū)(BC)設(shè)計一條共用的FAM標記下游引物。采用RT-PCR擴增TCR各BV家族CDR3區(qū)基因,擴增產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析,了解各BV家族的表達情況;(3)免疫掃描技術(shù)分析TCR BV家族譜系特點:取出6ul PCR擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2h,在373 DNA序列分析儀(ABI公司)中電泳,通過Peak Scanner Software v1.0進行數(shù)據(jù)分析,并使用扭曲率、缺失率、正態(tài)分布率、單峰率以及復(fù)合評分來分析TCR-CDR3譜系的完整性與多樣性。(4)TCRβ鏈CDR3序列測定:對經(jīng)免疫掃描分析證明有單克隆增生的TCRBV家族,用上述PCR反應(yīng)條件重新進行擴增,并對PCR產(chǎn)物直接測序。(5)統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS21軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,各組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗,P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(1)乙型肝炎病毒相關(guān)肝細胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫瘤組織TCR BV各家族RT-PCR結(jié)果。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)gelred染色,1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步分析,結(jié)果提示各例病人的TCR24個BV家族,大部分家族均有表達,少數(shù)BV家族呈現(xiàn)弱表達或不表達。(2)在10例HBV-RHCC患者外周血、非腫瘤肝組織與腫瘤組織TCR-CDR3 24個BV家族譜型圖上,多數(shù)家族呈現(xiàn)扭曲分布,表現(xiàn)為單克隆、寡克隆峰以及偏態(tài)峰,發(fā)生不同程度的譜型偏移;部分家族呈現(xiàn)大于8峰的正態(tài)分布峰或類正態(tài)分布峰;小部分家族表達頻率極低或缺失表現(xiàn)為無峰圖。(3)鑒于不同患者以及不同家族在一定程度上呈現(xiàn)不同的CDR3譜系,使用扭曲率、缺失率、正態(tài)率、單峰率以及復(fù)合評分來進一步全面分析CDR3譜系的完整性與多樣性。盡管在非腫瘤肝組織與腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于扭曲率、缺失率、正態(tài)分布率等方面的顯著性差異,但是在兩組中仍然能夠發(fā)現(xiàn)其中的分布差異。此外,外周血T淋巴細胞比非腫瘤肝組織有更高的正態(tài)分布率(P=0.041),而在其他指標未見顯著性差異。而相對于腫瘤組織而言,外周血T淋巴細胞擁有更加多樣性的譜系(復(fù)合評分P=0.042)。(4)CDR3譜系與肝癌家族病史、乙型肝炎病毒水平以及AFP水平之間關(guān)聯(lián)。當(dāng)分析肝癌家族史與CDR3譜系之間的關(guān)系時,我們發(fā)現(xiàn)在PBLs中肝癌家族史組患者CDR3譜系復(fù)合評分顯著高于非肝癌家族史組(P=0.016);而兩組間其他方面數(shù)據(jù)未見顯著差異(P0.05)。此外,我們比較不同水平的AFP、乙肝病毒定量與CDR3譜系的關(guān)系,但均未見顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。(3)分析BV家族優(yōu)勢利用時,我們發(fā)現(xiàn)TCR-BV1(80%),-BV3(43.3%),-BV7(53.3%),-BV14(53.3),與-BV21(56.7%)家族顯著高表達于HBV-RHCC患者的外周血、非腫瘤肝組織與腫瘤組織中。為了進一步分析優(yōu)勢利用,我們對免疫掃描證實為單克隆增生的家族進行TCRβ鏈CDR3序列測定,通過對比不同病例與不同組織的氨基酸序列時,發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律:(1)在不同的BV家族中未發(fā)現(xiàn)共有序列。(2)所有的共有序列均在相同的BV家族中發(fā)現(xiàn),(3)在相同的組織中發(fā)現(xiàn)了共有序列,(4)在不同的組織與不同的樣本中共有相關(guān)的序列。結(jié)論本研究使用免疫掃描技術(shù)對10例乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者的外周血、非腫瘤組織以及肝癌組織中的T淋巴細胞受體24可變區(qū)家族互補決定區(qū)3長度分布進行分析。發(fā)現(xiàn)了外周血、非腫瘤組織以及腫瘤組織中顯著差異的細胞免疫功能狀態(tài),并證實了在非腫瘤組織與腫瘤組織中存在著克隆性增殖。共有序列的發(fā)現(xiàn)為乙肝相關(guān)性肝細胞癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)與潛在的靶點。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62;R735.7
【圖文】：

18圖 1 乙型病毒相關(guān)性肝細胞癌患者正常 TCR-CDR3 各 BV 家族 PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果。整個膠版總共 28 個加樣孔，其中第一孔與第 28 孔為 DNA marker；第 2 孔至第 25 孔為TCR-CDR3 BV1-BV24 家族；第 26 孔為陽性對照 Gapdh；第 27 孔為陰性對照（未加入 cDNA模板）RT-PCR 產(chǎn)物，經(jīng) 1．5％瓊脂糖凝膠電泳分析圖(gelred 染色)， 大部分 PCR 擴增產(chǎn)物在不同位置均出現(xiàn)一條模糊的條帶。A：病例 4 外周血；B：病例 9 非腫瘤組織；C：病例 10 腫瘤組織。2.2 乙型病毒肝炎相關(guān)性肝細胞癌患者 TCR BV 家族 CDR3 譜型分析2.2.1 譜型初步分析

20圖 2. 樣本 4 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫瘤 TCR家族家族譜系匯總. (A) 外周血譜系分布： 單克�。築V1, BV3, BV21; 正態(tài)分布BV5, BV7, BV8, BV13, BV15, BV18, BV23；缺失峰： BV10, BV17, BV19. BV腫瘤肝組織譜系分布：單克隆峰 BV1, BV4, BV6, BV7, BV14, BV15, BV18, BV正態(tài)分布峰：BV2, BV5, BV9；缺失峰：BV10, BV11, BV16. BV17. BV19 (C) 布：單克隆峰：BV10,BV11,BV14,BV15,BV16,BV24；正態(tài)分布峰：BV2，BVBV9，BV12，BV13， BV18,，BV22,，BV23；缺失峰：BV19。X 軸方向的相位產(chǎn)物的大小，對應(yīng)于各譜型 CDR3 長度，Y 軸方向顯示的不同高度的峰為相應(yīng) 密度，即各 CDR3 的表達頻率。

21圖 3 為樣本 1 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌的 24BV 家族 CDR3 譜型基因掃描分析圖，X 軸為CDR3 長度，Y 軸為相應(yīng) PCR 產(chǎn)物的相對熒光密度，為各 BV 家族 CDR3 的表達頻率。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張光文;姚新生;馬世武;于樂成;王戰(zhàn)會;侯金林;;慢性無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者外周血T細胞受體譜型分析[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

2 張光文;姚新生;馬世武;楊創(chuàng)國;于樂成;侯金林;;慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞受體譜系分析及互補決定區(qū)3序列測定[J];中華肝臟病雜志;2006年01期

本文編號：2743124