乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌T淋巴細(xì)胞受體譜系初步研究
發(fā)布時(shí)間:2020-07-05 21:00
【摘要】:背景原發(fā)性肝癌是全球最常見的癌癥,乙型肝炎病毒是其主要的病因。一項(xiàng)基于亞太與北美的研究提示,慢性HBV感染發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌的機(jī)會(huì)是普通人群的25-37倍。但乙型肝炎患者高發(fā)肝癌的確切機(jī)制并不清楚。近年來新的研究證實(shí)微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,尤其是微環(huán)境中細(xì)胞免疫對(duì)腫瘤的發(fā)生起著更為關(guān)鍵的作用。Prendergast GC等人提出“癌癥是一種微環(huán)境和免疫疾病”這一重要概念。針對(duì)這一概念,有關(guān)學(xué)者也進(jìn)行了大量探討,研究主要集中在Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞失衡、NK細(xì)胞、Treg淋巴細(xì)胞、Th17細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。但評(píng)價(jià)肝細(xì)胞癌患者細(xì)胞免疫的整體狀況研究相對(duì)少見。T細(xì)胞受體互補(bǔ)決定區(qū)3譜型分析技術(shù)是一項(xiàng)很好的反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的新方法。本研究采用該技術(shù)分析乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者的局部與整體細(xì)胞免疫功能情況,并探討局部細(xì)胞免疫在肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的作用。目的采用T細(xì)胞受體譜型分析技術(shù)對(duì)乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫癌組織中T淋巴細(xì)胞的TCR CDR3譜型特征進(jìn)行分析,探討肝細(xì)胞癌患者整體細(xì)胞免疫與肝癌局部細(xì)胞免疫之間的差異,從而了解局部細(xì)胞免疫在肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的作用,為肝細(xì)胞癌免疫治療提供新的理論依據(jù)和客觀的評(píng)價(jià)方法。方法(1)收錄新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院2015年3月-8月手術(shù)切除的乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者10例,術(shù)前收集肝素化的外周血10-20ml。并于術(shù)后收集配對(duì)的非腫瘤肝組織與腫瘤組織.⑵RNA提取、c DNA合成以及PCR擴(kuò)增:使用總RNA提取試劑盒提取外周血、非腫瘤肝組織以及腫瘤組織總RNA,并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成c DNA。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成TCRBV 24個(gè)家族上游引物,并在B鏈恒定基因區(qū)(BC)設(shè)計(jì)一條共用的FAM標(biāo)記下游引物。采用RT-PCR擴(kuò)增TCR各BV家族CDR3區(qū)基因,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析,了解各BV家族的表達(dá)情況;(3)免疫掃描技術(shù)分析TCR BV家族譜系特點(diǎn):取出6ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2h,在373 DNA序列分析儀(ABI公司)中電泳,通過Peak Scanner Software v1.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并使用扭曲率、缺失率、正態(tài)分布率、單峰率以及復(fù)合評(píng)分來分析TCR-CDR3譜系的完整性與多樣性。(4)TCRβ鏈CDR3序列測(cè)定:對(duì)經(jīng)免疫掃描分析證明有單克隆增生的TCRBV家族,用上述PCR反應(yīng)條件重新進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫瘤組織TCR BV各家族RT-PCR結(jié)果。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)gelred染色,1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步分析,結(jié)果提示各例病人的TCR24個(gè)BV家族,大部分家族均有表達(dá),少數(shù)BV家族呈現(xiàn)弱表達(dá)或不表達(dá)。(2)在10例HBV-RHCC患者外周血、非腫瘤肝組織與腫瘤組織TCR-CDR3 24個(gè)BV家族譜型圖上,多數(shù)家族呈現(xiàn)扭曲分布,表現(xiàn)為單克隆、寡克隆峰以及偏態(tài)峰,發(fā)生不同程度的譜型偏移;部分家族呈現(xiàn)大于8峰的正態(tài)分布峰或類正態(tài)分布峰;小部分家族表達(dá)頻率極低或缺失表現(xiàn)為無峰圖。(3)鑒于不同患者以及不同家族在一定程度上呈現(xiàn)不同的CDR3譜系,使用扭曲率、缺失率、正態(tài)率、單峰率以及復(fù)合評(píng)分來進(jìn)一步全面分析CDR3譜系的完整性與多樣性。盡管在非腫瘤肝組織與腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于扭曲率、缺失率、正態(tài)分布率等方面的顯著性差異,但是在兩組中仍然能夠發(fā)現(xiàn)其中的分布差異。此外,外周血T淋巴細(xì)胞比非腫瘤肝組織有更高的正態(tài)分布率(P=0.041),而在其他指標(biāo)未見顯著性差異。而相對(duì)于腫瘤組織而言,外周血T淋巴細(xì)胞擁有更加多樣性的譜系(復(fù)合評(píng)分P=0.042)。(4)CDR3譜系與肝癌家族病史、乙型肝炎病毒水平以及AFP水平之間關(guān)聯(lián)。當(dāng)分析肝癌家族史與CDR3譜系之間的關(guān)系時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在PBLs中肝癌家族史組患者CDR3譜系復(fù)合評(píng)分顯著高于非肝癌家族史組(P=0.016);而兩組間其他方面數(shù)據(jù)未見顯著差異(P0.05)。此外,我們比較不同水平的AFP、乙肝病毒定量與CDR3譜系的關(guān)系,但均未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)分析BV家族優(yōu)勢(shì)利用時(shí),我們發(fā)現(xiàn)TCR-BV1(80%),-BV3(43.3%),-BV7(53.3%),-BV14(53.3),與-BV21(56.7%)家族顯著高表達(dá)于HBV-RHCC患者的外周血、非腫瘤肝組織與腫瘤組織中。為了進(jìn)一步分析優(yōu)勢(shì)利用,我們對(duì)免疫掃描證實(shí)為單克隆增生的家族進(jìn)行TCRβ鏈CDR3序列測(cè)定,通過對(duì)比不同病例與不同組織的氨基酸序列時(shí),發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律:(1)在不同的BV家族中未發(fā)現(xiàn)共有序列。(2)所有的共有序列均在相同的BV家族中發(fā)現(xiàn),(3)在相同的組織中發(fā)現(xiàn)了共有序列,(4)在不同的組織與不同的樣本中共有相關(guān)的序列。結(jié)論本研究使用免疫掃描技術(shù)對(duì)10例乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者的外周血、非腫瘤組織以及肝癌組織中的T淋巴細(xì)胞受體24可變區(qū)家族互補(bǔ)決定區(qū)3長(zhǎng)度分布進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)了外周血、非腫瘤組織以及腫瘤組織中顯著差異的細(xì)胞免疫功能狀態(tài),并證實(shí)了在非腫瘤組織與腫瘤組織中存在著克隆性增殖。共有序列的發(fā)現(xiàn)為乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)與潛在的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R512.62;R735.7
【圖文】:
18圖 1 乙型病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者正常 TCR-CDR3 各 BV 家族 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果。整個(gè)膠版總共 28 個(gè)加樣孔,其中第一孔與第 28 孔為 DNA marker;第 2 孔至第 25 孔為TCR-CDR3 BV1-BV24 家族;第 26 孔為陽性對(duì)照 Gapdh;第 27 孔為陰性對(duì)照(未加入 cDNA模板)RT-PCR 產(chǎn)物,經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析圖(gelred 染色), 大部分 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在不同位置均出現(xiàn)一條模糊的條帶。A:病例 4 外周血;B:病例 9 非腫瘤組織;C:病例 10 腫瘤組織。2.2 乙型病毒肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者 TCR BV 家族 CDR3 譜型分析2.2.1 譜型初步分析
20圖 2. 樣本 4 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫瘤 TCR家族家族譜系匯總. (A) 外周血譜系分布: 單克。築V1, BV3, BV21; 正態(tài)分布BV5, BV7, BV8, BV13, BV15, BV18, BV23;缺失峰: BV10, BV17, BV19. BV腫瘤肝組織譜系分布:?jiǎn)慰寺》?BV1, BV4, BV6, BV7, BV14, BV15, BV18, BV正態(tài)分布峰:BV2, BV5, BV9;缺失峰:BV10, BV11, BV16. BV17. BV19 (C) 布:?jiǎn)慰寺》澹築V10,BV11,BV14,BV15,BV16,BV24;正態(tài)分布峰:BV2,BVBV9,BV12,BV13, BV18,,BV22,,BV23;缺失峰:BV19。X 軸方向的相位產(chǎn)物的大小,對(duì)應(yīng)于各譜型 CDR3 長(zhǎng)度,Y 軸方向顯示的不同高度的峰為相應(yīng) 密度,即各 CDR3 的表達(dá)頻率。
21圖 3 為樣本 1 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的 24BV 家族 CDR3 譜型基因掃描分析圖,X 軸為CDR3 長(zhǎng)度,Y 軸為相應(yīng) PCR 產(chǎn)物的相對(duì)熒光密度,為各 BV 家族 CDR3 的表達(dá)頻率。
本文編號(hào):2743124
【學(xué)位授予單位】:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R512.62;R735.7
【圖文】:
18圖 1 乙型病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者正常 TCR-CDR3 各 BV 家族 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果。整個(gè)膠版總共 28 個(gè)加樣孔,其中第一孔與第 28 孔為 DNA marker;第 2 孔至第 25 孔為TCR-CDR3 BV1-BV24 家族;第 26 孔為陽性對(duì)照 Gapdh;第 27 孔為陰性對(duì)照(未加入 cDNA模板)RT-PCR 產(chǎn)物,經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析圖(gelred 染色), 大部分 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在不同位置均出現(xiàn)一條模糊的條帶。A:病例 4 外周血;B:病例 9 非腫瘤組織;C:病例 10 腫瘤組織。2.2 乙型病毒肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者 TCR BV 家族 CDR3 譜型分析2.2.1 譜型初步分析
20圖 2. 樣本 4 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者外周血、非腫瘤組織與腫瘤 TCR家族家族譜系匯總. (A) 外周血譜系分布: 單克。築V1, BV3, BV21; 正態(tài)分布BV5, BV7, BV8, BV13, BV15, BV18, BV23;缺失峰: BV10, BV17, BV19. BV腫瘤肝組織譜系分布:?jiǎn)慰寺》?BV1, BV4, BV6, BV7, BV14, BV15, BV18, BV正態(tài)分布峰:BV2, BV5, BV9;缺失峰:BV10, BV11, BV16. BV17. BV19 (C) 布:?jiǎn)慰寺》澹築V10,BV11,BV14,BV15,BV16,BV24;正態(tài)分布峰:BV2,BVBV9,BV12,BV13, BV18,,BV22,,BV23;缺失峰:BV19。X 軸方向的相位產(chǎn)物的大小,對(duì)應(yīng)于各譜型 CDR3 長(zhǎng)度,Y 軸方向顯示的不同高度的峰為相應(yīng) 密度,即各 CDR3 的表達(dá)頻率。
21圖 3 為樣本 1 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的 24BV 家族 CDR3 譜型基因掃描分析圖,X 軸為CDR3 長(zhǎng)度,Y 軸為相應(yīng) PCR 產(chǎn)物的相對(duì)熒光密度,為各 BV 家族 CDR3 的表達(dá)頻率。
【參考文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前2條
1 張光文;姚新生;馬世武;于樂成;王戰(zhàn)會(huì);侯金林;;慢性無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者外周血T細(xì)胞受體譜型分析[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期
2 張光文;姚新生;馬世武;楊創(chuàng)國(guó);于樂成;侯金林;;慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞受體譜系分析及互補(bǔ)決定區(qū)3序列測(cè)定[J];中華肝臟病雜志;2006年01期
本文編號(hào):2743124
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