【摘要】： 背景: 飲酒過(guò)量已成為嚴(yán)重社會(huì)問(wèn)題,乙醇是現(xiàn)代社會(huì)濫用最廣的成癮物質(zhì)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,過(guò)量攝入乙醇可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多方面不利影響,如酒精性肝炎、脂肪肝等,并可影響糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的體內(nèi)代謝。正常血糖水平對(duì)維持機(jī)體能量代謝有著重要作用,而乙醇攝入對(duì)糖代謝的影響已引起廣泛關(guān)注。資料顯示,急性乙醇中毒可導(dǎo)致嚴(yán)重低血糖,但在一定條件下,乙醇又可導(dǎo)致高血糖,并認(rèn)為這主要取決于體內(nèi)糖原儲(chǔ)備是否充足。研究乙醇對(duì)糖原代謝的影響具有重要意義。 糖原合成與分解是肝臟生化功能的重要方面,它不僅為自身的生理活動(dòng)提供能量,也為其他器官的能量需要提供葡萄糖,血糖水平下降引起機(jī)體儲(chǔ)備的糖原分解和糖異生作用增強(qiáng)。糖原合酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成過(guò)程的關(guān)鍵酶,其活性受到磷酸化形式的調(diào)節(jié)。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthasekinase-3,GSK-3)則可在體內(nèi)磷酸化糖原合酶,使其失活,負(fù)調(diào)控糖原合成。GSK-3為絲/蘇氨酸蛋白激酶,有兩個(gè)同功異構(gòu)體,分別是GSK-3α、GSK-3β。GSK-3本身亦可被磷酸化(GSK-3α的Ser~(21)或GSK-3β的Ser~9)而失活,使得糖原合酶的磷酸化受到抑制,從而促進(jìn)糖原合成。測(cè)定GSK-3的水平,能反映出活性GS的表達(dá)狀況。目前研究較多集中于GSK-3β。有研究認(rèn)為,乙醇攝入后可減少大鼠肝臟糖原含量,降低大鼠肝臟糖原合酶的活性及表達(dá),但并未報(bào)道對(duì)GSK-3β的影響,亦未見(jiàn)關(guān)于乙醇對(duì)人類肝細(xì)胞GSK-3β影響的報(bào)道。 腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)為外周組織細(xì)胞內(nèi)的能量感受器,近年來(lái)被認(rèn)為與糖代謝過(guò)程關(guān)系密切,它有α、β、γ三個(gè)亞單位,細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高可激活A(yù)MPK,其中α亞單位Thr~(172)的磷酸化(P-AMPK)對(duì)AMPK激活,發(fā)揮其激酶活性至關(guān)重要。每克乙醇本身可提供熱量7.1kcal/g,干擾機(jī)體能量代謝。目前有研究報(bào)道,乙醇作用后,小鼠的AMPK活性可增強(qiáng)或降低,而對(duì)于乙醇對(duì)人類肝細(xì)胞反應(yīng)能量代謝的AMPK的影響以及AMPK對(duì)GSK-3的變化又有何影響目前仍是未知領(lǐng)域。 乙醇對(duì)糖原代謝過(guò)程的研究較少,而對(duì)人類肝細(xì)胞糖原代謝的影響更是罕見(jiàn)報(bào)道。本研究選取正常人類肝L02細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察乙醇直接作用后,人肝L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量變化,并進(jìn)一步研究乙醇對(duì)糖原合成代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶GSK-3β的影響、P-AMPK的表達(dá)變化,初步探討P-AMPK對(duì)GSK-3β的影響。 目的: 1、研究乙醇對(duì)體外培養(yǎng)的人肝L02細(xì)胞糖原含量及GSK-3β、P-AMPK的影響。 2、通過(guò)加入AMPK的激動(dòng)劑(5-Aminoimidazole-4-carboxamide -1-b-Dribofur-anoside,AICAR)與阻斷劑(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyyrazolo[1,5-a]pyrimidine,Compound C),間接觀察P-AMPK對(duì)GSK-3β的影響。 方法: 人肝L02細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下在改良RPMI 1640中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代,每2-3 d換液。在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中加入乙醇,并按加入乙醇濃度的不同分為0 mmol/L組、50 mmol/L組、100 mmol/L組,0 mmol/L組細(xì)胞正常換液,培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞;采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定細(xì)胞糖原濃度,同時(shí)提取細(xì)胞DNA并測(cè)定濃度;蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)GSK-3β及P-AMPK表達(dá)水平;并用AICAR(0.5 mmol/L)和Compound C(10μmol/L)預(yù)處理0mmol/L組和100 mmol/L組細(xì)胞1h,再與乙醇共同作用24 h,檢測(cè)GSK-3β蛋白表達(dá)。結(jié)果采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: 1、50 mmol/L組和100 mmol/L組分別與0 mmol/L組相比較: (1)L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量分別下降41.3%(P＜0.01)和52.8%(P＜0.01); (2)GSK-3β表達(dá)相對(duì)水平分別增加15.2%(P=0.011)和20.1%(P=0.002); (3)P-AMPK表達(dá)相對(duì)水平分別增加8.99%(P=0.002)和10.3%(P=0.001); (4)50 mmol/L和100 mmol/L兩組比較,糖原含量、GSK-3β及P-AMPK表達(dá)相對(duì)水平均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、加入AICAR和Compound C后,0 mmol/L組和100 mmol/L組GSK-3β表達(dá)均未見(jiàn)明顯變化,兩組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、乙醇作用后明顯降低體外培養(yǎng)的人肝L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量,可能干擾其糖原合成。 2、乙醇作用后人肝L02細(xì)胞內(nèi)GSK-3β表達(dá)增加,推測(cè)其與糖原含量下降有關(guān)。 3、乙醇作用后P-AMPK表達(dá)增加,推測(cè)乙醇干擾了L02細(xì)胞的能量變化,導(dǎo)致P-AMPK的變化,并且AMPK的變化可能促進(jìn)了糖原合成代謝的下降。 4、加入AICAR后,0 mmol/L組和100 mmol/L組GSK-3β表達(dá)均未見(jiàn)明顯變化,提示乙醇引起糖原含量變化的過(guò)程中,P-AMPK與GSK-3β未見(jiàn)明顯的相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575
【圖文】：

表2乙醇培養(yǎng)24h后各組糖原含量測(cè)定值比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(x士s，n=6)Table2StatistiesofGlyeogeneontentafterethanolexPosurefor24h(壯s，n=695%ConfideneeIn;ig.一235000000235000000乙醇組別(mmol幾)LSDO50100100100MC即Dill七rCnCC(I一J).013426(*).017148(*)一013426(*).003722一017148(*)一003722Std.Error.00300670030067.0030067.0030067.0030067.0030067LowerBound.007017.010739一019835一002687一023556一010130UB.一.一.*Themeandifferenee15signifieantatthe.05level.

0Illmol幾50mmo比100mmo比圖3不同乙醇處理組GSK一鄧蛋白表達(dá)水Fig.3ExPressionofGSK一3pindiffereniethgrouPsbywesternblot0加叨01幾50n.01幾1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2734693