乙醇對人肝LO2細胞糖原和GSK-3β、P-AMPK的影響

發(fā)布時間：2020-06-30 02:03

【摘要】： 背景: 飲酒過量已成為嚴重社會問題,乙醇是現(xiàn)代社會濫用最廣的成癮物質(zhì)。流行病學調(diào)查顯示,過量攝入乙醇可對機體產(chǎn)生多方面不利影響,如酒精性肝炎、脂肪肝等,并可影響糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的體內(nèi)代謝。正常血糖水平對維持機體能量代謝有著重要作用,而乙醇攝入對糖代謝的影響已引起廣泛關注。資料顯示,急性乙醇中毒可導致嚴重低血糖,但在一定條件下,乙醇又可導致高血糖,并認為這主要取決于體內(nèi)糖原儲備是否充足。研究乙醇對糖原代謝的影響具有重要意義。糖原合成與分解是肝臟生化功能的重要方面,它不僅為自身的生理活動提供能量,也為其他器官的能量需要提供葡萄糖,血糖水平下降引起機體儲備的糖原分解和糖異生作用增強。糖原合酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成過程的關鍵酶,其活性受到磷酸化形式的調(diào)節(jié)。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthasekinase-3,GSK-3)則可在體內(nèi)磷酸化糖原合酶,使其失活,負調(diào)控糖原合成。GSK-3為絲/蘇氨酸蛋白激酶,有兩個同功異構體,分別是GSK-3α、GSK-3β。GSK-3本身亦可被磷酸化(GSK-3α的Ser~(21)或GSK-3β的Ser~9)而失活,使得糖原合酶的磷酸化受到抑制,從而促進糖原合成。測定GSK-3的水平,能反映出活性GS的表達狀況。目前研究較多集中于GSK-3β。有研究認為,乙醇攝入后可減少大鼠肝臟糖原含量,降低大鼠肝臟糖原合酶的活性及表達,但并未報道對GSK-3β的影響,亦未見關于乙醇對人類肝細胞GSK-3β影響的報道。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)為外周組織細胞內(nèi)的能量感受器,近年來被認為與糖代謝過程關系密切,它有α、β、γ三個亞單位,細胞內(nèi)AMP/ATP比值升高可激活AMPK,其中α亞單位Thr~(172)的磷酸化(P-AMPK)對AMPK激活,發(fā)揮其激酶活性至關重要。每克乙醇本身可提供熱量7.1kcal/g,干擾機體能量代謝。目前有研究報道,乙醇作用后,小鼠的AMPK活性可增強或降低,而對于乙醇對人類肝細胞反應能量代謝的AMPK的影響以及AMPK對GSK-3的變化又有何影響目前仍是未知領域。乙醇對糖原代謝過程的研究較少,而對人類肝細胞糖原代謝的影響更是罕見報道。本研究選取正常人類肝L02細胞作為研究對象,觀察乙醇直接作用后,人肝L02細胞內(nèi)糖原含量變化,并進一步研究乙醇對糖原合成代謝過程中的關鍵酶GSK-3β的影響、P-AMPK的表達變化,初步探討P-AMPK對GSK-3β的影響。目的: 1、研究乙醇對體外培養(yǎng)的人肝L02細胞糖原含量及GSK-3β、P-AMPK的影響。 2、通過加入AMPK的激動劑(5-Aminoimidazole-4-carboxamide -1-b-Dribofur-anoside,AICAR)與阻斷劑(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyyrazolo[1,5-a]pyrimidine,Compound C),間接觀察P-AMPK對GSK-3β的影響。方法: 人肝L02細胞于37℃、5%CO2條件下在改良RPMI 1640中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代,每2-3 d換液。在處于對數(shù)生長期的細胞中加入乙醇,并按加入乙醇濃度的不同分為0 mmol/L組、50 mmol/L組、100 mmol/L組,0 mmol/L組細胞正常換液,培養(yǎng)24 h后,收集細胞;采用蒽酮-硫酸比色法測定細胞糖原濃度,同時提取細胞DNA并測定濃度;蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測GSK-3β及P-AMPK表達水平;并用AICAR(0.5 mmol/L)和Compound C(10μmol/L)預處理0mmol/L組和100 mmol/L組細胞1h,再與乙醇共同作用24 h,檢測GSK-3β蛋白表達。結果采用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。結果: 1、50 mmol/L組和100 mmol/L組分別與0 mmol/L組相比較: (1)L02細胞內(nèi)糖原含量分別下降41.3%(P＜0.01)和52.8%(P＜0.01); (2)GSK-3β表達相對水平分別增加15.2%(P=0.011)和20.1%(P=0.002); (3)P-AMPK表達相對水平分別增加8.99%(P=0.002)和10.3%(P=0.001); (4)50 mmol/L和100 mmol/L兩組比較,糖原含量、GSK-3β及P-AMPK表達相對水平均未見明顯統(tǒng)計學意義。 2、加入AICAR和Compound C后,0 mmol/L組和100 mmol/L組GSK-3β表達均未見明顯變化,兩組間未見明顯統(tǒng)計學意義。結論: 1、乙醇作用后明顯降低體外培養(yǎng)的人肝L02細胞內(nèi)糖原含量,可能干擾其糖原合成。 2、乙醇作用后人肝L02細胞內(nèi)GSK-3β表達增加,推測其與糖原含量下降有關。 3、乙醇作用后P-AMPK表達增加,推測乙醇干擾了L02細胞的能量變化,導致P-AMPK的變化,并且AMPK的變化可能促進了糖原合成代謝的下降。 4、加入AICAR后,0 mmol/L組和100 mmol/L組GSK-3β表達均未見明顯變化,提示乙醇引起糖原含量變化的過程中,P-AMPK與GSK-3β未見明顯的相關性。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575
【圖文】：

糖原含量,乙醇,組間,測定值

表2乙醇培養(yǎng)24h后各組糖原含量測定值比較的統(tǒng)計學分析(x士s，n=6)Table2StatistiesofGlyeogeneontentafterethanolexPosurefor24h(壯s，n=695%ConfideneeIn;ig.一235000000235000000乙醇組別(mmol幾)LSDO50100100100MC即Dill七rCnCC(I一J).013426(*).017148(*)一013426(*).003722一017148(*)一003722Std.Error.00300670030067.0030067.0030067.0030067.0030067LowerBound.007017.010739一019835一002687一023556一010130UB.一.一.*Themeandifferenee15signifieantatthe.05level.

乙醇處理,蛋白表達