【摘要】：背景和目的 慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）是指各種原因所致的胰實質(zhì)和胰管的不可逆慢性炎癥，其緩慢發(fā)展的病變最終可引起胰腺壞死、纖維化，腺泡和胰島細胞萎縮消失，導致胰腺結(jié)構(gòu)破壞和胰腺內(nèi)、外分泌功能減退或喪失。其典型的病理表現(xiàn)為胰腺實質(zhì)纖維化、腺泡細胞萎縮等，而胰腺纖維化的主要特征之一是大量纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)沉淀。在胰腺纖維化中，胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells,PSC）是參與胰腺纖維化的主要效應細胞。PSC分為靜止和活化兩種表現(xiàn)型。在未損傷的胰腺組織中PSC呈靜止狀態(tài)。胰腺受損時，在各種刺激因子的作用下使PSC活化，能產(chǎn)生Ⅰ型、Ⅲ型膠原及纖連蛋白等主要的細胞外基質(zhì)，在胰腺纖維化中起重要作用。導致PSC活化的最重要的促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子和血小板衍生生長因子通過旁分泌激活PSC。因此，抑制PSC的活化和誘導其凋亡來抗胰腺纖維化成為可能。 骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于骨髓支持結(jié)構(gòu)的一群成體干細胞，其具有自我更新、多向分化能力和較強的增殖能力，在不同的條件下可分化為骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞樣細胞等，是細胞治療和基因工程的重要種子細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞能分泌多種細胞因子，如白細胞介素、干細胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、肝細胞生長因子及神經(jīng)生長因子等。不僅能抑制胰腺炎癥反應，還能阻止胰腺發(fā)生纖維化，減少纖維化的發(fā)生。IκBα的突變形式IκBαM則能與核轉(zhuǎn)錄因子-κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)發(fā)生不可逆性的結(jié)合形成三聚體以無活性的復合物形式存在于細胞胞質(zhì)中。使NF-κB處以靜息狀態(tài)，從而起到抑制炎癥反應和促進細胞凋亡的作用。因此，本實驗通過轉(zhuǎn)染入IκBαM基因的MSCs與PSC間接共培養(yǎng)，觀察MSCs對PSC有無抑制作用，并探討其機制是否與抑制炎癥因子引起的炎癥反應及抑制NF-κB的活性有關(guān)，從而產(chǎn)生抑制PSC的活化和促進其凋亡作用，為進一步進行體內(nèi)試驗提供理論基礎和實驗依據(jù)。全文分為兩部分進行研究。 材料與方法 1.重組腺相關(guān)病毒IκBαM在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達 選擇增殖旺盛期的MSCs按5×10~4個/孔接種入24孔板，共8孔，其中2孔留作細胞計數(shù)用。37℃5%CO_2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。觀察細胞是否正常，計數(shù)細胞。用無血清的DMED培養(yǎng)液將細胞系兩遍。按感染復數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)值（v.g/cell）分別為2×10~4、1×10~5、5×10~5計算所需加入帶有綠色熒光蛋白的重組腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)IκBαM病毒的體積數(shù)，在試管中將需加入的rAAV-IκBαM病毒與無血清的DMEM培養(yǎng)液混合。將上述rAAV-IκBαM病毒與無血清的DMEM混合液分別加入每孔細胞中，每孔細胞加200μl。并作復孔。將24孔板置于37℃5%CO_2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5~6h后，吸去每孔液體，加入1ml/孔含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃5%CO_2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后，在熒光顯微鏡下觀察MSCs是否發(fā)出綠色熒光，Western blot法檢測IκBαM的表達。 2.轉(zhuǎn)染IκBαM骨髓間充質(zhì)干細胞對胰腺星狀細胞的體外調(diào)控 以Transwell insert作為培養(yǎng)體系上層，接種骨髓間充質(zhì)干細胞2×10~4個/孔，以培養(yǎng)板為培養(yǎng)體系下層，接種胰腺星狀細胞2×10~4個/孔，建立上下雙層細胞培養(yǎng)體系，IκBαM-MSCs與PSC共培養(yǎng)為A組(實驗組)，單純MSCs與PSC共培養(yǎng)為B組(對照組)，單純培養(yǎng)的胰腺星狀細胞為C組(空白組)。各組均常規(guī)培養(yǎng)。96h后ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-1、IL-6、TNF-α和PDGF的濃度及細胞內(nèi)NF-κBp65的濃度。流式細胞儀檢測PSC的凋亡，PCR法檢測凋亡基因BNIP3在PSC中的表達。 結(jié)果 1.重組腺相關(guān)病毒IκBαM在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達 1.1rAAV-IκBαM感染MSCs細胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達。 1.2Western blot檢測結(jié)果顯示rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染組有IκBαM強陽性條帶，rAAV-GFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組為弱陽性條帶。rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染MSCs3d后在細胞裂解液中IκBαM含量明顯高于rAAV-GFP轉(zhuǎn)染組和對照組。 2.轉(zhuǎn)染IκBαM骨髓間充質(zhì)干細胞對胰腺星狀細胞的體外調(diào)控 2.1在三組培養(yǎng)液中，與C組相比，A組和B組IL-1、IL-6、TNF-α、PDGF濃度均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)；A組、B組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2.2在三組培養(yǎng)液中，與B組、C組相比，A組NF-κBp65濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)；B組、C組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結(jié)論 1．rAAV-IκBαM能高效的擴增，并且能有效的感染靶細胞MSCs，對MSCs的增殖生長無明顯影響，能在MSCs細胞內(nèi)穩(wěn)定高水平的表達。 2．轉(zhuǎn)染IκBαM基因的MSCs可降低體外培養(yǎng)的PSC細胞培養(yǎng)基中炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α和PDGF的水平，并能抑制PSC細胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，具有抑制炎癥反應和促進細胞凋亡的雙重作用。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R576

【參考文獻】

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1 李兆申;;干細胞與重癥急性胰腺炎[J];胃腸病學;2007年03期

本文編號：2730157