【摘要】：目的:第一部分:有研究表明,胰腺以外的組織在糖尿病的生理病理過程中也起到一定的作用。腸源激素對胰島細(xì)胞有很大影響,并且在糖尿病發(fā)病過程中有一定的作用。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)鼠的小腸有胰島素原基因的表達(dá)。在本研究第一部分中,我們通過形態(tài)學(xué)的方法確定小腸中胰島素合成的具體部位,從基因和蛋白質(zhì)水平證明小腸中有胰島素的表達(dá),同時(shí)研究不同腸段的胰島素表達(dá)水平是否存在差異,為進(jìn)一步研究腸源胰島素對胰腺細(xì)胞的影響及糖尿病發(fā)病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。第二部分:冷刺激和運(yùn)動(dòng)的干預(yù)會(huì)使得小鼠肝臟的基因表達(dá)改變,有利于加速脂肪和糖類代謝。冷刺激所引起的肌肉戰(zhàn)栗與運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌收縮相似可以介導(dǎo)白色脂肪棕色化。因此,第二部分我們將探究冷刺激和運(yùn)動(dòng)對非酒精性脂肪性肝病的影響。方法:第一部分:我們以健康的6周齡C57BL/6J小鼠的小腸為研究對象,處死前禁食8h,測量小鼠的血糖值,脫頸處死小鼠后,將小鼠的小腸按照十二指腸,空腸,回腸分別取樣,小鼠小腸組織長度大約在24-30cm左右,其中十二指腸,空腸,回腸大約各占全長的三分之一。將剪取的組織樣本制成石蠟包埋切片,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測有胰島素存在的部位。從組織樣本中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胰島素mRNA在不同腸道組織中的相對表達(dá)量。對組織中提取的蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行蛋白免疫印跡電泳實(shí)驗(yàn),檢測小腸中是否有胰島素蛋白存在、各腸段表達(dá)量是否有差異。第二部分:選取6周齡C57BL/6J雄性小鼠24只,6周齡KKay自發(fā)性雄性肥胖小鼠24只,將其分別分為4組:常溫組,常溫運(yùn)動(dòng)組,冷刺激組,冷刺激運(yùn)動(dòng)組。C57BL/6J小鼠給予普通飲食,KKay自發(fā)性肥胖小鼠給予KKay小鼠高脂飲食。利用高通量測序及GEO數(shù)據(jù)庫分析確定要檢測的差異基因,再通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡電泳檢測不同組別的肝臟基因表達(dá)有何種變化,結(jié)果:免疫熒光檢測結(jié)果顯示,在小鼠小腸的腸絨毛及腸隱窩有胰島素、PDX1及ICA-512的表達(dá),在同一腸段內(nèi)胰島素表達(dá)的位置和表達(dá)量未見明顯差異。電子掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小腸隱窩附近的細(xì)胞內(nèi)有類似胰島素的分泌顆粒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示小鼠小腸內(nèi)有胰島素的mRNA表達(dá),空腸表達(dá)量稍高。蛋白質(zhì)水平的蛋白免疫印跡電泳實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了小腸細(xì)胞內(nèi)有胰島素蛋白質(zhì)存在,而其表達(dá)水平差異同mRNA的表達(dá)水平差異一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡電泳均顯示出在冷刺激和運(yùn)動(dòng)的干預(yù)下,小鼠的肝臟基因表達(dá)出現(xiàn)了變化,與脂肪及能量代謝相關(guān)的基因如FASN和AMPK的表達(dá)量明顯上調(diào)。結(jié)論:小腸中有胰島素基因表達(dá),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有胰島素蛋白存在。由于胰島素在其正常的生理過程中不存在進(jìn)入細(xì)胞膜的過程,所以我們可以認(rèn)為,在小腸細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的胰島素蛋白為小腸細(xì)胞自身合成得,而不是從胰腺轉(zhuǎn)運(yùn)來的。我們還發(fā)現(xiàn)在小腸中,以空腸的胰島素合成量最多,十二指腸和回腸比空腸略低,且在正常血糖水平下三者都遠(yuǎn)低于胰腺的胰島素表達(dá)量;我們之前的研究也發(fā)現(xiàn),腸源胰島素的分泌高峰同胰腺胰島素不同,因此我們猜測腸源胰島素可能具有同胰腺胰島素不同的作用。冷刺激和運(yùn)動(dòng)使得肝臟的FASN和AMPK表達(dá)上升,AMPK磷酸化增加,在促進(jìn)脂肪代謝,控制體重方面有著重要的作用,冷刺激與運(yùn)動(dòng)相結(jié)合的干預(yù)方式也為控制體重、預(yù)防肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生提供了一種新思路。
【圖文】：

15 1：A，在十二指腸(duodenum),空腸(jejunum)，回腸(ileum)及胰腺中檢測到的胰島素DX1，有部分細(xì)胞呈胰島素、PDX1 雙陽性，放大倍數(shù) 1000 倍。B，小腸及胰腺中檢測到ICA-512，放大倍數(shù) 400 倍。

空腸(圖 2B)，回腸(圖2C)中都存在類似胰島素的分泌顆粒，表達(dá)量上并無明顯差異。結(jié)合上述免疫熒光檢測的結(jié)果，形態(tài)學(xué)觀察表明小腸中的胰島素存在于細(xì)胞內(nèi)部，眾所周知，胰島素是作用在細(xì)胞表面胰島素受體的一種蛋白質(zhì)，胰島素在完成生理作用的過程中會(huì)同細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合，而不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，所以可以認(rèn)為，我們檢測到的胰島素是由小腸細(xì)胞自身合成的，，并非由胰島 β細(xì)胞合成再經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來。圖 2：電鏡檢測小腸中的胰島素分泌顆粒，→所指為胰島素分泌顆粒，N 為細(xì)胞核，ML 為肌肉層，IC 為小腸隱窩。1.3.3 熒光定量 PCR &蛋白免疫印跡電泳檢測顯示小腸有胰島素存在我們以 β-actin 為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測十二指腸、空腸、回腸和胰腺中胰島素 mRNA 的相對表達(dá)量(圖 3A)�？漳c與十二指腸和回腸的胰島素相對表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 小于 0.05），小腸組織與胰腺之間差異極為明顯（P 小于 0.01）。通過蛋白免疫印跡電泳對小腸中胰島素表達(dá)量的檢測得到了和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 相一致的結(jié)果(圖 3B)，選取 GAPDH 作為內(nèi)參
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5

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