【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是所有國家公共的衛(wèi)生問題,已有2億多人被影響。雖然從1982年就有高效的乙肝病毒疫苗,可是仍有4.0多億慢性攜帶者,而且其中75%的攜帶者在亞洲太平洋地區(qū)。慢性HBV感染導(dǎo)致的肝炎后肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等終末期肝病,目前已成為危害中國人民生命健康的主要疾病。近些年來雖然有新型抗HBV藥物不斷出現(xiàn),但是其療效不盡如人意,仍然需要探索新型的抗HBV的治療方法。α干擾素是抗HBV藥物之一,然而有相當(dāng)部分病人無應(yīng)答。這些無應(yīng)答的患者中α干擾素不敏感的機(jī)制是難以捉摸的。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中一些干擾素刺激基因的表達(dá)增加與α干擾素治療無應(yīng)答組有關(guān)。因此,深入了解RNAi抑制泛素特異性肽酶(ubiquitin specific peptidase18,USP18)的表達(dá)以及調(diào)控具有重要的意義。目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建重組USP18 RNAi慢病毒,并且篩選出最有顯著抑制USP18表達(dá)的重組RNAi慢病毒；然后轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后觀察HBV DNA及干擾素敏感基因15(IFN-sensitive gene,ISG15)的表達(dá)。方法：在本研究中,我們在體外化學(xué)合成針對USP18基因的三個(gè)靶點(diǎn)siRNAJ序列(siRNA1,siRNA2,siRNA3),以慢病毒載體介導(dǎo)下構(gòu)建重組USP18 RNAi慢病毒,轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞5天后,實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)檢測USP18 mRNA的表達(dá)水平,從中篩選抑制率最高的重組USP18 RNAi慢病毒；然后再轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞時(shí)加入長效聚乙二醇干擾素(Pegylated interferon alfa-2a,PEG-IFNα),分五組,AN和B組為重組siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組,C組和D組為未轉(zhuǎn)染組,E組為空白組；其中,A組和C組培養(yǎng)于含有PEG-IFNα、含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中,B組和D組培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中。即A組為PEG-IFNα+USP18-RNAi-LV 1#,B組為USP18-RNAi-LV 1#,C組為PEG-IFNa+NC-GFP-LV,D組為NC-GFP-LV,E組為空白組),在8h、3天、7天后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集HepG2.2.15細(xì)胞的上清液檢測HBVDNA的表達(dá),并在感染后3天收集HepG2.2.15細(xì)胞的蛋白用westernblot檢測ISG15蛋白的表達(dá)。結(jié)果：我們成功地構(gòu)建了重組USP18 RNAi慢病毒(即USP18-RNAi-LV1#, USP18-RNAi-LV2#, USP18-RNAi-LV3#)。在重組USP18RNAi漫病毒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞5天后,RT-PCR結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)的siRNAl,siRNA2,siRNA3組重組慢病毒與對照組(陰性組：NC-GFP-LV,空白組)相比均有不同程度地抑制USP18mRNA的表達(dá),且成功篩選出最有效抑制USP18表達(dá)的重組慢病毒USP18-RNAi-LV 1#(P0.05)。然后重組慢病毒USP18-RNAi-LV1#轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后,隨著時(shí)間的推移,對HBV復(fù)制抑制作用越來越顯著,尤其A組。而western blot結(jié)果提示A組的ISG15蛋白表達(dá)增加,進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果,在蛋白水平得到了進(jìn)一步驗(yàn)證沉默USP18的表達(dá)能增強(qiáng)α干擾素抗病毒的活性,具有一定的臨床意義。討論：通過上述實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建USP18 RNAi重組慢病毒,通過沉默USP18的表達(dá)增強(qiáng)干擾素的抗病毒作用,為慢性乙型肝炎患者的治療帶來新的希望。相信隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默USP18的表達(dá)在抗HBV的基礎(chǔ)研究必將走向臨床應(yīng)用。
【圖文】：

幼三姐:ENLS+NPCiFP-LVFigure1-9the11urdGroup:EN.S+NC-GFP-LV

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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

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本文編號：2682468