【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染呈世界范圍廣泛流行,全球僅慢性HBV攜帶者就有近四億人。如果不經(jīng)過(guò)恰當(dāng)治療的話,至少有6千萬(wàn)人會(huì)過(guò)早地因肝病而死亡。根據(jù)HBV全基因序列異質(zhì)性≥8%的界線,可將HBV分為A～H八種不同的基因型。這些基因型反映了HBV自然感染時(shí)發(fā)生變異的特點(diǎn),是病毒變異進(jìn)化的結(jié)果。現(xiàn)有研究表明HBV基因型與疾病的臨床表現(xiàn)、治療效果及預(yù)后有密切的聯(lián)系。 HBV具有獨(dú)特的生活周期,由于其復(fù)制需通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制,且其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3’→5’外切核酸酶活性,故HBV變異較為常見(jiàn)。并且,在內(nèi)源性(宿主免疫清除)和外源性(疫苗和抗病毒藥物)的選擇性壓力作用下,更容易選擇出逃避突變株。 核苷(酸)類似物是目前臨床上治療HBV感染的重要抗病毒藥物,此類藥物通過(guò)直接抑制HBV DNA復(fù)制,進(jìn)而改善肝臟組織學(xué)病變,延緩乙肝病情進(jìn)展,減少合并癥的發(fā)生。但長(zhǎng)期治療發(fā)生病毒耐藥是此類藥物面臨的共同問(wèn)題。對(duì)抗病毒藥物耐藥可導(dǎo)致病毒學(xué)反彈及病情惡化。因此,具有強(qiáng)效、低耐藥及無(wú)交叉耐藥的抗HBV藥物對(duì)于預(yù)防肝病的發(fā)展具有十分重要的意義。阿德福韋(ADV)是基本符合上述3個(gè)條件的藥物。 本項(xiàng)研究針對(duì)我院ADVⅢ期臨床5個(gè)項(xiàng)目238例慢性乙肝患者,所有患者均為HBeAg陽(yáng)性,阿德福韋酯每天10mg,療程48周(具體方案詳見(jiàn)相關(guān)章節(jié))。我們首先對(duì)所有HBV標(biāo)本進(jìn)行基因分型,了解本地區(qū)基因型的分布狀況;然后分析ADV治療慢性乙肝患者,不同基因型在治療過(guò)程中病毒學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)等方面反應(yīng)的差異;最后對(duì)臨床耐藥毒株進(jìn)行HBV DNA逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)及全基因組測(cè)序分析,篩選耐藥毒株的變異位點(diǎn),從分子層面解析HBV耐藥的機(jī)制。 在第一部份研究?jī)?nèi)容中我們首次通過(guò)對(duì)GenBank中所有S基因900余條核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,找出了各基因型的型特異核苷酸,并根據(jù)GenBank中HBV 12株G型、11株H型序列自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增G型、H型的型特異引物(國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有HBV G型、H型的報(bào)道),采用A～H基因型特異性引物-PCR分型法成功對(duì)218株HBV進(jìn)行分型,結(jié)合S區(qū)測(cè)序,型特異核苷酸分析對(duì)余下20株也完成了分型。結(jié)果表明:B基因型159例、C型69例、B+C和B+D混合型分別有6例和4例。B型、C型、B+C和B+D混合型檢出率分別為66.8%、28.9%、2.5%和1.6%。本地區(qū)基因型分布以B型和C型為主,少量D基因型以混合感染方式存在,未檢出A、E、F、、G和H基因型。 對(duì)其中3株HBV進(jìn)行全基因組序列分析顯示:No.21和No.55 nt1838位均為a,按Ba與Bj定義劃分No.21和No.55屬于Ba亞型。進(jìn)一步作序列比對(duì)分析顯示No.21、No.55與Ba亞型差異最小(≤0.16%),屬于Ba亞型,No.124與C基因型差異最小(≤2.0%),屬于C基因型。這兩種方法的劃分結(jié)果與型特異引物PCR法相一致。 對(duì)41株B基因型pol酶RT區(qū)核苷酸、氨基酸序列分析顯示其中40株某些氨基酸位點(diǎn)與Bj(日本亞型rt153R、rt207V和rt272C)亞型高度一致,而與Ba(亞州亞型rt153W、rt207M、rt272W)亞型不相符。由于RT區(qū)負(fù)責(zé)HBV前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA并指導(dǎo)正鏈DNA的合成,在進(jìn)化上相對(duì)保守,說(shuō)明本地區(qū)HBV病毒株與Bj亞型具有遺傳學(xué)同源性,同時(shí)又具有與該地區(qū)之外的其它Ba亞型不相同的遺傳學(xué)特性,據(jù)此,我們認(rèn)為可以從Ba亞型進(jìn)一步細(xì)分出Bac亞亞型,c代表重慶地區(qū)首次分離到的該型病毒株。 在第二部份研究?jī)?nèi)容中我們?cè)诨蚍中突A(chǔ)上以回顧性分析的方式研究了阿德福韋酯Ⅲ期臨床4個(gè)項(xiàng)目177例(B基因型102例,C基因型65例,10例為B+C和B+D混合型)慢性乙肝患者不同基因型對(duì)抗病毒治療患者血清生化指標(biāo)及病毒學(xué)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示:治療48周時(shí)基因型B組和基因型C組HBV DNA下降均值分別為3.6log10copies/ml和3.1log10copies/ml,差異具有顯著性(P 0.05),而第12周、24周時(shí)兩組差異無(wú)顯著性(P 0.05)。治療48周時(shí)基因型B組和基因型C組分別有43例(42.2%)和22例(33.8%)出現(xiàn)血清HBV DNA陰轉(zhuǎn),差異具有顯著性(P 0.05);兩組HBeAg陰轉(zhuǎn)率和抗HBe血清轉(zhuǎn)換率差異無(wú)顯著性(P 0.05)。各時(shí)間段兩組ALT復(fù)常率無(wú)顯著性差異(P 0.05)。結(jié)果表明阿德福韋酯治療慢性乙肝48周時(shí),部份病毒學(xué)指標(biāo)(如血清HBV DNA下降均值和HBV DNA陰轉(zhuǎn)率)基因型B可能優(yōu)于基因型C。但由于阿德福韋酯抗病毒作用起效較緩慢,因此,需要更長(zhǎng)的觀察時(shí)間來(lái)證實(shí)這一現(xiàn)象。 在第三部份研究?jī)?nèi)容中根據(jù)HBV DNA值篩選出原發(fā)性耐藥毒株21株及繼發(fā)性耐藥毒株9株。對(duì)HBV pol酶RT區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、核苷酸及氨基酸序列比對(duì)分析,我們首次發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)rtN118H、rtM271L和rtY141F,其發(fā)生率分別為:23.8%、14.3%和14.3%。未發(fā)現(xiàn)rtN236T和A181V/T突變。1例患者出現(xiàn)1個(gè)RT區(qū)C保守區(qū)氨基酸變異(rtM207V);6例患者出現(xiàn)9個(gè)HBV RT非保守區(qū)氨基酸變異。我們還成功構(gòu)建了3條耐藥毒株治療前全基因序列,分析發(fā)現(xiàn)X基因、Core/e基因及BCP區(qū)均有重要位點(diǎn)發(fā)生變異。上述研究提示阿德福韋酯耐藥株的氨基酸變異不僅見(jiàn)于RT B區(qū)181和D區(qū)236位點(diǎn), C區(qū)207位點(diǎn)、RT非保守區(qū)和調(diào)控區(qū)也可發(fā)生多個(gè)變異,從而對(duì)HBV的耐藥性產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R512.62;R450

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本文編號(hào)：2682345