【摘要】：一、研究背景及目的原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)最終結(jié)局是肝硬化,典型病理學(xué)改變是肝內(nèi)小膽管慢性非化膿性破壞性膽管炎及膽汁性肝硬化,肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(IBEC)損害明顯。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),通過(guò)抑制EMT可延緩或阻斷肝纖維化進(jìn)程。體內(nèi)EMT受多因素影響,IL-17A在EMT中作用近年倍受重視。因組織器官和疾病的差異,IL-17A在細(xì)胞EMT及器官纖維化中的研究結(jié)論不一。當(dāng)前研究尚未明確IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT及其分子機(jī)制,以及該病理過(guò)程在PBC發(fā)病中的價(jià)值。本研究結(jié)合臨床病理及免疫組化研究了 PBC發(fā)展過(guò)程中IBEC-EMT發(fā)生情況以及IL-17A表達(dá)變化,并探索相關(guān)胞內(nèi)信號(hào)途徑以闡明IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT的分子機(jī)制,初步闡明IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT在PBC發(fā)病機(jī)制中的意義。二、研究?jī)?nèi)容1、通過(guò)PBC病例臨床、病理分析及肝臟組織免疫組化,檢測(cè)PBC患者是否發(fā)生IBEC-EMT,肝內(nèi)膽管中IL-17A表達(dá)變化以及外周血IL-17A等炎性細(xì)胞因子的變化,評(píng)價(jià)以上指標(biāo)與PBC發(fā)病的相關(guān)性。2、通過(guò)IBEC的體外培養(yǎng),觀察IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT,并探索其可能的分子機(jī)制。2.1建立EMT經(jīng)典細(xì)胞模型:分別用不同濃度TGFβ1干擾培養(yǎng)IBEC,在不同時(shí)間檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA及蛋白表達(dá)水平的改變,主要為驗(yàn)證IBEC可以誘導(dǎo)出EMT,為下一步實(shí)驗(yàn)給予細(xì)胞、試劑、條件、方法等方面做準(zhǔn)備。2.2觀察IL-17A是否可誘導(dǎo)出IBEC-EMT:在不同時(shí)間應(yīng)用不同濃度IL-17A干擾培養(yǎng)IBEC,觀察細(xì)胞形態(tài)變化及檢測(cè)EMIT相關(guān)標(biāo)志物mRNA及蛋白表達(dá)水平,證實(shí)IL-17A可誘導(dǎo)出IBEC-EMT,并探索其最佳時(shí)間和濃度,為后續(xù)分子機(jī)制探索奠定基礎(chǔ)。2.3應(yīng)用siRNA沉默IBEC相應(yīng)靶基因,檢測(cè)IL-17A干擾培養(yǎng)IBEC可能信號(hào)通路上相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)變化情況,探索IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT分子機(jī)制。3、IL-17A和 TGF-β1 共同干擾培養(yǎng) IBEC,觀察 IL-17A對(duì) TGF-β1 誘導(dǎo) IBEC-EMT的影響。三、研究方法1、ELISA檢測(cè)以下血清中的生物標(biāo)志物及細(xì)胞因子:血清IL-17A、AMA-M2、IL-6、IL-8、IL-23、MIP3a/CCL20、TGFβ1 的檢測(cè)。2、速率散射比濁法檢測(cè)以下特定蛋白:血清IgG、IgA、IgM、C3、C4、ASO、RHF、CRP、輕鏈κ、輕鏈λ、游離KAP、游離LAM。3、HE染色直接觀察肝臟的病理情況及病理分期。4、免疫組組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IBEC-EMT標(biāo)志物及相關(guān)指標(biāo),包括CK7、CK19、Vimentin、E-cadherin、IL17A、IL17AR。5、IL-17A誘導(dǎo)IBEC-EMT及其分子機(jī)制,主要應(yīng)用技術(shù)包括:細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、Quantitative real-time RT-PCR、Western blotting、siRNA 干擾等。四、研究結(jié)果1、PBC患者反映膽汁淤積TBIL、DBIL、GGT、ALP等多項(xiàng)生理生化指標(biāo)均存在明顯異常,血清IL-6、IL-8、MIP-3a、TGFβ1、IL-17A等多種相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平明顯升高。2、HE染色分析9例不同分期的(Ⅰ期3例、Ⅱ期4例、Ⅲ期2例)的PBC病例以及4例正常人肝組織的病理學(xué)改變,結(jié)果顯示:PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin明顯降低,間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin明顯增高,同時(shí)IL-17A、IL-17RA表達(dá)升高,提示在PBC發(fā)展過(guò)程中伴隨IBEC-EMT的發(fā)生,且此過(guò)程可能與IL-17A介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。3、TGFβ1誘導(dǎo)IBEC-EMT最佳濃度為5ng/ml,最佳時(shí)間為48h。4、IL-17A可誘導(dǎo)IBEC-EMT,最佳濃度為50ng/ml,最佳時(shí)間為48h。5、IL-17A干擾培養(yǎng)IBEC,轉(zhuǎn)染siRNA-Act1可阻斷IBEC-EMT過(guò)程,同時(shí)下游信號(hào)通路上Act1、P65/p-P65、p-IκB等多種信號(hào)蛋白表達(dá)異常。6、IL-17A和TGF-β1共同干擾培養(yǎng)誘導(dǎo)IBEC-EMT較單獨(dú)應(yīng)用明顯。五、研究結(jié)論1、PBC患者多項(xiàng)生理生化指標(biāo)異常,外周血清IL-17A等多種炎性細(xì)胞因子水平升高,可能與PBC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。2、PBC患者存在IBEC-EMT及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞IL-17A、IL-17RA高表達(dá),IL-17A可能參與PBC肝內(nèi)膽管IBEC-EMT。3、IL-17A 誘導(dǎo) IBEC-EMT 可能是通過(guò) IL-17A-IL-17RA-Act1-NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮作用。4、IL-17A與TGF-β1對(duì)IBEC-EMT過(guò)程起協(xié)同作用。
【圖文】：

１．４．２邋ＨＥ染色分期及膽管標(biāo)志物ＣＫ７、ＣＫ１９免疫組化結(jié)果逡逑ＨＥ染色分析９例ＰＢＣ組織病理學(xué)分期：Ｉ期３例、ＩＩ期４例、ＩＩＩ期２例；逡逑４例正常肝組織。如圖１－２所示圖Ｂ、Ｄ、Ｆ示ＰＢＣ患者鏡下肝組織小葉結(jié)構(gòu)完逡逑整，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，部分肝細(xì)胞水腫，部分肝細(xì)胞羽毛樣變性，肝細(xì)胞點(diǎn)逡逑狀、灶狀壞死，局灶融合壞死，肝ＩＩ區(qū)可見(jiàn)少許膽栓形成，中央靜脈擴(kuò)張，周逡逑邊肝細(xì)胞壞死，纖維組織增生；匯管區(qū)可見(jiàn)６個(gè)，周邊膽管增生，間質(zhì)內(nèi)混合逡逑性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部輕度界面炎，匯管區(qū)擴(kuò)大，并呈星芒狀延伸，局部呈弓狀逡逑包繞肝組織，ＣＫ７、ＣＫ１９免疫組化示膽管增生，該病例形態(tài)符合ＰＢＣ病理分逡逑期ＩＩ期；圖Ａ、Ｃ、Ｅ是ＨＣ對(duì)照組鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見(jiàn)脂肪變逡逑性

邐４８ｈ邐ＩＬ－１７Ａ邋５０ｎｇ／ｍｌ逡逑圖２－３邋ＩＬ－１７Ａ干擾培養(yǎng)ＩＢＥＣ凋亡實(shí)驗(yàn)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－３邋Ｔｈｅ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＩＢＥＣ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｗｉｔｈ邋ＩＬ－１７Ａ逡逑２．４．５邋ＩＬ－１７Ａ邋誘導(dǎo)邋ＩＢＥＣ－ＥＭＴ邋信號(hào)通路逡逑ＩＬ－１７Ａ誘導(dǎo)ＩＢＥＣ－ＥＭＴ可能主要通過(guò)以下信號(hào)通路發(fā)揮作用：ＩＬ－１７Ａ—逡逑ＩＬ－１７ＲＡ—Ａｃｔｌ—ＮＦ－ＫＢ，，在邋ＩＬ－１７Ａ邋誘導(dǎo)的情況下，用邋ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ邋沉默邋ＩＢＥＣ逡逑相應(yīng)蛋白的表達(dá)，檢測(cè)相關(guān)ｍＲＮＡ及蛋白衣達(dá)情況。逡逑２．４．５．１邋瞬時(shí)轉(zhuǎn)染邋ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ邋ＩＢＥＣ邋６ｈ邋結(jié)果逡逑圖２－４可見(jiàn)，ｃｙ３標(biāo)記的轉(zhuǎn)染對(duì)照ｓｉＲＮＡ，無(wú)化學(xué)修飾，與實(shí)驗(yàn)中的靶基逡逑因ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ共同轉(zhuǎn)染ＩＢＥＣ邋６小時(shí)，在倒置相差熒光顯微鏡下可觀察到幾乎逡逑所有細(xì)胞膜上有較強(qiáng)紅色熒光出現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Bin Liu;Xuan Zhang;Feng-Chun Zhang;Jin-Bao Zong;Wen Zhang;Yan Zhao;;Aberrant TGF-β1 signaling contributes to the development of primary biliary cirrhosis in murine model[J];World Journal of Gastroenterology;2013年35期

2 Zeng-Fu Xue;Xiu-Min Wu;Ming Liu;;Hepatic regeneration and the epithelial to mesenchymal transition[J];World Journal of Gastroenterology;2013年09期

3 李平;張浩軍;鄭柳濤;;The Theory of Homogeny of Liver and Kidney in the Treatment of Kidney and Liver Fibrosis[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2012年04期

4 施沛青;朱書(shū);錢(qián)友存;;IL-17的信號(hào)傳導(dǎo)及功能研究[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年04期

本文編號(hào)：2680993