【摘要】： 急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見的急腹癥之一,特別是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)來勢兇猛,病程進展快,合并感染的病死率可高達25%。大量研究顯示,腸道黏膜屏障損傷及其介導(dǎo)的病理改變在其發(fā)病過程中起到了關(guān)鍵的作用。AP時腸道屏障功能受到損害會直接導(dǎo)致細菌和內(nèi)毒移位,引起腸源性感染和內(nèi)毒素血癥,并進一步激發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征( systemic- inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ disfunction syndrome, MODS)。 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是細胞表面一類受體,它在炎癥、免疫、病源體識別中都起著十分重要的作用。其中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)作為LPS受體可識別來自G-細菌的LPS,其與急性胰腺炎相關(guān)腸道損傷的關(guān)聯(lián)性已得到證實,并逐漸引起重視。已知TLR4是發(fā)現(xiàn)最早的TLRs亞型之一,近十幾年來對其研究最多,其信號傳導(dǎo)通路也最為明確,某種因素激活TLR4后,通過一系列信號傳導(dǎo),產(chǎn)生炎癥放大效應(yīng)。 TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括MyD88依賴性和非依賴性途徑;TLR4主要通過MyD88依賴性途徑,MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)核因子-κΒ(NF-κΒ)活化、細胞因子的產(chǎn)生。研究表明急性胰腺炎時腸道微血管內(nèi)皮細胞和白細胞內(nèi)的黏膜固有層TLR4的表達增多。馬繼民等研究發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎時腸黏膜TLR4的表達水平與腸黏膜通透性指數(shù)明顯相關(guān),與腸黏膜的病理學(xué)改變也呈相關(guān)性。目前已經(jīng)研制出TLR4單克隆抗體(TLR4mAb),并將其應(yīng)用至潰瘍性結(jié)腸炎小鼠身上,發(fā)現(xiàn)其能減輕潰瘍性結(jié)腸炎的病情。因此我們也推測將TLR4mAb注入急性胰腺炎大鼠的腹腔內(nèi)也會減輕胰腺炎對腸黏膜的損傷。 目的: 本研究通過建立大鼠AP模型,并給予TLR4mAb,觀察腸道病理學(xué)、二胺氧化酶(DAO)活性變化、TLR4和NF-κΒp65蛋白表達以及炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6的釋放,探討TLR4在急性胰腺炎相關(guān)性腸道損傷中的作用,并探討TLR4單克隆抗體對急性胰腺炎腸黏膜損傷的治療效果。 方法: 1動物模型的制備 選取雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口進入腹腔,用4號加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管,以0.2ml/min速度注入5%�；悄懰徕c(0.1ml/100g),推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處,觀察3min,剪除結(jié)扎線,關(guān)腹。 2實驗分組 將雄性wistar大鼠18只,隨機分為假手術(shù)組(SO組, n=6)、急性胰腺炎組(AP組,n=6)、TLR4單克隆抗體治療組(TLR4mAb組,n=6)。TLR4mAb于造模后立即經(jīng)腹腔注射,劑量為50μg/只。 3生化指標測定取血清樣本,采用全自動血清生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶活性,由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室協(xié)助測定。 4胰腺、腸道組織病理學(xué) 采用石蠟切片,HE染色。 5 DAO活力測定 取腸組織制成組織勻漿,采用1995年黎君友等改良的分光光度法,檢測腸組織勻漿二胺氧化酶(DAO)活性。 6腸組織TNF-α、IL-6的測定 取腸組織制成勻漿,嚴格按照大鼠放射免疫試劑盒說明書要求檢測。 7免疫組織化學(xué)染色測定腸組織TLR4、NF-kBp65表達: 脫蠟至水,抗原熱修復(fù)后,用3%過氧化氫孵育15min。封閉一抗4℃過夜,陰性對照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min,后用3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,復(fù)染后封片。以細胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達,并進行免疫組化評分。 8 western bloting法測定 腸組織TLR4、NF-kBp65表達:100mg腸組織經(jīng)勻漿器徹底粉碎,加入1ml細胞裂解液,充分裂解,提取TLR4膜蛋白(具體操作按說明書),和NF-κΒp65胞漿蛋白,分別取100μg與上樣緩沖液充分混合,置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至NC膜,以5%的脫脂奶粉封閉,一抗(1:250)4C孵育過夜,以相應(yīng)的二抗室溫下孵育2h,抗體檢測按Santa Cruz公司試劑盒說明書進行。 結(jié)果: 1血清淀粉酶、脂肪酶變化與SO組比較,在AP組和TLR4mAb組血清淀粉酶和血清脂肪酶水平均顯著升高(P0.05)。與AP組比較,TLR4mAb組血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低(P0.05)。 2胰腺的病理學(xué)變化 在SO組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)大致正常;AP組和TLR4 mAb組,胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死,腹腔出現(xiàn)血性腹水。 3腸組織病理學(xué)變化 SO組腸組織結(jié)構(gòu)大致正常。AP組和TLR4mAb組,可見腸道充血、水腫,蠕動減弱,炎細胞浸潤伴點狀出血,并有淋巴濾泡增生,絨毛出現(xiàn)水腫增粗,甚至壞死脫落。 4腸組織勻漿DAO活力變化 與SO組相比,AP組與TLR4mAb組DAO活力明顯下降(P0.05)。與AP組相比,TLR4mAb組DAO活力明顯上升(P 0.05)。 5腸組織勻漿TNF-α、IL-6測定 與SO組相比,在AP組和TLR4mAb組TNF-α、IL-6水平均顯著升高(P0.05)。與AP組比較,在TLR4mAb組TNF-α、IL-6水平顯著降低(P0.05)。 6免疫組化測定 TLR4在腸組織中的表達:與SO組相比,AP組與TLR4mAb組TLR4表達明顯增強(P0.05)。AP組在的回腸黏膜表面,黏膜固有層的淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞,黏膜下層的動靜脈、縱形和環(huán)形肌層等處都有比較強的TLR4表達,免疫組化評分顯示,TLR4mAb組表達強度低于AP組(P 0.05)。 腸組織NF-κΒp65活化:與SO組相比,AP組與TLR4mAb組NF-κΒp65活性明顯增強(P0.05)。AP組腸黏膜可見大量細胞核呈棕褐色染色的陽性細胞,主要為腸絨毛頂端的腸上皮細胞和靠近腸絨毛頂端的單核細胞,TLR4mAb組表達強度低于AP組(P 0.05)。 7 western bloting測定 TLR4在腸組織中的表達:光密度掃描分析顯示,在SO組腸組織有弱的TLR4表達,AP組和TLR4mAb組TLR4表達明顯增強(P 0.05)。與AP組相比,在TLR4mAb組表達減弱(P 0.05)。 NF-κΒp65在腸組織中的表達:光密度掃描分析顯示,在SO組腸組織有弱的NF-κΒp65表達,在AP組、TLR4mAb組NF-κΒp65表達均明顯增強(P0.05)。與AP組相比,TLR4mAb組NF-κΒp65表達減弱(P 0.05)。 結(jié)論: 1逆行膽胰管內(nèi)注射5%牛磺膽酸鈉,通過檢測血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死,腸組織水腫、充血、出血,DAO活性下降,標明AP大鼠存在相關(guān)性腸道損傷。 2在AP大鼠腸組織中,TLR4及下游通路中NF-κΒp65表達均明顯高于對照組,表明TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在AP相關(guān)性腸道損傷中可能發(fā)揮作用。 3 TLR4mAb是近年來發(fā)明的TLR4單克隆抗體,能降低TLR4及下游通路中NF-κΒp65表達,改善腸黏膜通透性和炎癥損傷,認為TLR4單克隆抗體對大鼠AP相關(guān)性腸道損傷有治療作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R576

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