【摘要】：研究背景和目的肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是多種慢性肝病的共同病理過程,晚期肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭、門靜脈高壓甚至肝癌。肝纖維化是由于肝臟受到多種內(nèi)外界因素刺激或持續(xù)性肝臟損傷,引發(fā)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)和修復(fù)機制,損傷的肝細胞可以激活肝星狀細胞,使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞,肌成纖維細胞通過分泌纖維原性因子促進肝細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)沉積形成。肝纖維化是一個動態(tài)過程,表現(xiàn)為ECM合成大于降解。當肝纖維化逐漸加重時,正常的肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞和改建,沉積的纖維包圍成假小葉,即形成不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化。當前肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)的調(diào)控機制仍不明確,若能發(fā)現(xiàn)和闡明肝纖維化形成的調(diào)控機制,可為肝纖維化的預(yù)防和治療提供新的手段,為肝纖維化藥物研發(fā)提供新的策略和方法。近年來,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)在肝臟疾病發(fā)展過程中的作用越來越受到人們的關(guān)注。肝細胞在應(yīng)對外界刺激時,蛋白質(zhì)的合成和分泌明顯增加。同時,各種損傷因素作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),將共同加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷,導(dǎo)致未折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積,刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上感受蛋白,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞的一種自我調(diào)節(jié)機制,可導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR),UPR可以激活相關(guān)啟動子mRNA產(chǎn)生,通過降低全細胞蛋白質(zhì)合成,表達特定分子伴侶,促進蛋白質(zhì)正確折疊等途徑,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷,最終達到緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的目的。UPR會導(dǎo)致多種效應(yīng),包括適應(yīng)緩解、炎癥反應(yīng)、自噬和凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后具體通過何種途徑引起肝纖維化目前還不清楚。FAH(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)基因剔除大鼠(簡稱Fah~(-/-)大鼠)因為酪氨酸代謝障礙產(chǎn)生肝纖維化表型。人Fah基因的缺失將導(dǎo)致I型遺傳性高酪氨酸血癥(hereditary tyrosinemia type 1,HT1)。本研究通過應(yīng)用酪氨酸代謝障礙誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型(Fah~(-/-)大鼠),討論酪氨酸代謝障礙引起的肝細胞損傷導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及隨后的肝細胞凋亡在肝纖維化發(fā)生中扮演的角色。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在酪氨酸代謝障礙導(dǎo)致的肝纖維化中顯著激活,且應(yīng)激無法得到恢復(fù)。同時,其促凋亡信號通路激活,引發(fā)肝細胞凋亡。通過給予藥物緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,則可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激走向恢復(fù)而不引發(fā)細胞凋亡反應(yīng),從而減輕和治愈肝纖維化。進一步的,我們的研究還發(fā)現(xiàn),與Fah~(-/-)大鼠相反,相同病因的Fah~(-/-)小鼠肝損傷后并不發(fā)生肝纖維化,檢測發(fā)現(xiàn)Fah~(-/-)小鼠肝細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,但其致凋亡信號通路沒有激活,肝細胞損傷后不發(fā)生凋亡,最終不形成肝纖維化。通過研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其引發(fā)的凋亡作為肝損傷與肝纖維化之間的紐帶作用,本研究提出可將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為肝纖維化新的治療靶點。本研究將加深對肝纖維化發(fā)生機制的認識,為臨床診斷治療肝纖維化和藥物研發(fā)提供新策略。研究方法1.飼養(yǎng)繁殖和鑒定Fah~(-/-)大鼠,在飲水中停止添加NTBC藥物從而誘導(dǎo)肝損傷,建立Fah~(-/-)大鼠肝損傷后誘導(dǎo)肝纖維化的病理模型并開展相關(guān)分析。2.以撤除NTBC的Fah~(-/-)大鼠作為對照組,撤除NTBC同時給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解藥物苯基丁酸(4-PBA)的Fah~(-/-)大鼠作為實驗組,觀察緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否對實驗組大鼠肝纖維化具有抑制作用。3.觀察相同基因缺陷的Fah~(-/-)小鼠肝損傷后的肝纖維化表型并開展相關(guān)分析。4.應(yīng)用I型遺傳性酪氨酸血癥患者的肝臟標本,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在HT1患者中的激活情況。研究結(jié)果1.Fah~(-/-)大鼠停止NTBC給藥后,毒性代謝產(chǎn)物增加持續(xù)誘導(dǎo)肝細胞損傷,肝臟形成明顯的纖維化表型。2.損傷的Fah~(-/-)大鼠肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路激活,肝細胞發(fā)生凋亡。3.與肝損傷前Fah~(-/-)大鼠相比,損傷后的肝臟發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路激活,肝細胞發(fā)生凋亡。4.Fah~(-/-)小鼠肝損傷后不發(fā)生肝纖維化,肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上調(diào),但沒有發(fā)生細胞凋亡。5.I型酪氨酸血癥患者肝臟標本中可檢測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路蛋白激活,肝細胞發(fā)生凋亡,和Fah~(-/-)大鼠具有相似的表型。6.患有I型酪氨酸血癥的人肝臟可檢測到肝細胞凋亡,與正常人類肝臟相比,CHOP和TUNEL染色細胞陽性率顯著增加。結(jié)論1.模擬人I型酪氨酸代謝障礙的Fah~(-/-)大鼠模型發(fā)生肝損傷后,出現(xiàn)了與人類疾病類似的肝纖維化病理表型,出現(xiàn)AST、ALT升高,肝星狀細胞激活,炎癥因子分泌,免疫細胞的招募和活化等。2.損傷的Fah~(-/-)大鼠肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路,凋亡相關(guān)因子CHOP的表達促進肝細胞的凋亡,肝臟內(nèi)凋亡細胞增多,不斷產(chǎn)生的凋亡小體引發(fā)炎癥反應(yīng)激活肝星狀細胞,促使纖維原性因子分泌,導(dǎo)致肝內(nèi)纖維沉積進而發(fā)生肝纖維化。3.Fah~(-/-)小鼠肝損傷后發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,但強度不足以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路激活,從而不發(fā)生肝纖維化。4.利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解藥物治療Fah~(-/-)大鼠肝損傷,用過抑制PERK/IRE1-CHOP通路,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡,可以緩解肝臟炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),減少肝星狀細胞激活,從而顯著抑制Fah~(-/-)大鼠肝損傷后肝纖維化的程度。5.HT1患者肝臟標本中可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細胞凋亡。綜上,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在酪氨酸代謝性肝損傷導(dǎo)致的肝纖維化中發(fā)揮了重要作用,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細胞凋亡是其致肝纖維化的機制之一,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以作為臨床治療肝纖維化潛在的用藥靶點。
【圖文】：

實驗結(jié)果一、Fah-/-大鼠基因型的鑒定課題所采用的 SD 品系 Fah-/-大鼠為中科院惠利健實驗室建立，改大鼠模型采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立。利用設(shè)計的 sgRNA，引發(fā) Fah 基因第二外顯子突變，導(dǎo)致移碼突變或者翻譯提前終止（圖 1A）。實驗所用大鼠出生后四周采用剪鼠尾提取DNA 的方法，通過設(shè)計的 PCR 引物，進行 Fah 基因擴增，對大鼠基因型進行鑒定（圖 1B）。Fah-/-大鼠飲用水中加入藥物 NTBC 治療酪氨酸代謝異常，飼養(yǎng) 6 月余，其體態(tài)毛發(fā)、活動程度與正常大鼠無異。體重增長曲線與野生型大鼠對比無明顯差異（圖 1C）。對于飲用水中給予 NTBC 藥物飼養(yǎng)的 Fah-/-大鼠進行肝功能檢測，其各項指標與野生型大鼠無明顯差異（圖 2）。結(jié)果表明，大鼠的 Fah 基因為突變型基因純合子，其肝細胞無法表達正常 FAH 蛋白，而給予 NTBC 藥物飲水的 Fah-/-大鼠，其表型、生長狀況及肝功能與野生型大鼠沒有顯著差別。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在酪氨酸代謝障礙誘導(dǎo)肝纖維化中的作用和機制研究程度加劇，，F(xiàn)ah-/-大鼠肝臟顏色逐漸變?yōu)榘迭S色，表面粗糙，呈顆粒狀，邊緣變鈍，質(zhì)地變硬。在損傷 30 天時，肝臟部分表面已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的壞死和出血區(qū)域，肝臟表面可見明顯的小結(jié)節(jié)，這是肝纖維化向肝硬化發(fā)展的表現(xiàn)（圖 3C）。對停藥Fah-/-大鼠行眼底靜脈叢取血術(shù)，全血放置凝血后取上層血清進行肝功能各項指標檢測，結(jié)果表明發(fā)生酪氨酸代謝障礙的 Fah-/-大鼠各項肝功能指標均隨肝損傷時間進展而發(fā)生異常：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著提高，血清白蛋白（ALB）顯著下降，說明酪氨酸代謝障礙積累的毒性代謝產(chǎn)物給 Fah-/-大鼠肝細胞造成了嚴重損傷，血內(nèi)總膽紅素（TBIL）升高提示 Fah-/-大鼠肝損傷后出現(xiàn)膽汁排出受阻（圖 4）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2661583