【摘要】： 背景和目的: IL-6是目前公認(rèn)能刺激肝細(xì)胞增殖最重要的因子,它可通過JAK/STAT3(Signal transducer and activator of transcription-3)信號通路啟動或調(diào)節(jié)肝再生過程。肝臟損傷或肝葉切除肝再生過程中,IL-6表達(dá)上調(diào),并活化STAT3,活化的STAT3即磷酸化的STAT3(pSTAT3)可以進(jìn)入到核內(nèi)迅速誘導(dǎo)即刻早期基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)與炎癥、細(xì)胞增殖、急性期反應(yīng)等有關(guān)的基因表達(dá),以及促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝再生。Tmub1(transmemebrane and ubiquitin-like domain containing 1)基因是2005年由Della Fazia等通過對肝切除后肝細(xì)胞的cDNA文庫與對照組肝細(xì)胞比較分析后首次報道,當(dāng)時命名為hepatocyte odd protein shuttling(Hops)。其研究結(jié)果顯示:肝細(xì)胞的Tmub1 mRNA在肝部分切除術(shù)(PH術(shù))后明顯增加;同時,過表達(dá)Tmub1可阻斷大鼠H-35肝癌細(xì)胞增殖;而且,應(yīng)用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對Tmub1進(jìn)行RNA干擾后引起的NIH-3T3細(xì)胞增殖也可由于Tmub1的過表達(dá)而發(fā)生增殖抑制。研究還發(fā)現(xiàn),HOPS/Tmub1與eEF-1A(延長因子1-A)結(jié)合從而干擾蛋白質(zhì)的合成。因此我們推測,Tmub1在肝細(xì)胞增殖和肝再生過程中擔(dān)負(fù)著非常復(fù)雜而又重要的功能,在肝臟再生過程中起到傳遞肝細(xì)胞增殖信號或調(diào)控細(xì)胞增殖關(guān)鍵點的作用,但目前未見報道。如能闡明Tmub1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在肝細(xì)胞增殖中的作用,對肝細(xì)胞增殖和肝再生機(jī)制的研究將是一個重要發(fā)現(xiàn)。 在本實驗研究中,我們構(gòu)建了Tmub1基因RNAi慢病毒表達(dá)載體,利用RNA干擾技術(shù),沉默Tmub1,使大鼠肝BRL-3A細(xì)胞Tmub1基因不發(fā)揮功能,以探討Tmub1在IL-6誘導(dǎo)的STAT3表達(dá)及活化中的作用,更加深入地了解Tmub1與IL-6/JAK/STAT3信號傳導(dǎo)通路之間的關(guān)聯(lián)。以求在將來能為肝功能衰竭的研究與治療提供新的理論依據(jù)。 方法: 1.利用RNA干擾(RNAi)技術(shù),構(gòu)建Tmub1 RNAi慢病毒真核表達(dá)載體:即針對Tmub1基因設(shè)計、合成4對編碼發(fā)夾RNA(shRNA)的寡核普酸序列,退火后分別將其克隆入pll3.7質(zhì)粒。酶切、測序鑒定正確后,將pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和干擾質(zhì)粒(Pll3.7)組成的四質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,對四個Tmub1干擾質(zhì)粒載體進(jìn)行包裝,并用倒置熒光顯微鏡在目的細(xì)胞大鼠肝BRL-3A細(xì)胞上驗證慢病毒的感染效率,Western-Blot檢測慢病毒對目的細(xì)胞中Tmub1表達(dá)的干擾效果。 2.針對干擾效果最佳的干擾質(zhì)粒進(jìn)行包裝和大量生產(chǎn)Tmub1 RNAi慢病毒載體LV256;隨后使用Hela細(xì)胞通過流式細(xì)胞技術(shù)測定病毒滴度;最后,用G418抗生素篩選Tmub1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系BRL-3A/256,利用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測穩(wěn)定感染細(xì)胞系中Tmub1的表達(dá)情況,為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。 3.為了研究肝細(xì)胞中IL-6與Tmub1之間的關(guān)系,將實驗分為5組:Control組、Negative組、IL-6組、LV256組和IL-6+LV256組。其中,Negative組為僅感染了Pll3.7空載體質(zhì)粒的大鼠BRL-3A細(xì)胞;IL-6組為根據(jù)文獻(xiàn)報道方法用5ng/ml的重組大鼠IL-6對BRL-3A細(xì)胞進(jìn)行干預(yù);LV256組為BRL-3A/256穩(wěn)定感染細(xì)胞系(Tmub1表達(dá)被有效抑制);IL-6+LV256組為使用5ng/ml重組大鼠IL-6對Tmub1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系BRL-3A/256進(jìn)行干預(yù)。使用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測各組Tmub1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。 4.為了進(jìn)一步探討Tmub1 RNAi對IL-6誘導(dǎo)的STAT3表達(dá)及磷酸化的作用,我們同樣在實驗過程中采用上述分組方式,使用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測各組STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)表達(dá)水平的變化。以探討Tmub1與IL-6/JAK/STAT3信號通路之間的關(guān)系。 結(jié)果: 1.將設(shè)計合成的四個shDNA模板經(jīng)退火、載體線性化和連接反應(yīng),使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,并用Xba I和Nhe I分別對四個重組載體(C0019、C0020、C0021、C0022)進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。結(jié)果證實,Tmub1 shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確,表明Tmub1 shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。 2.用pRSV-Rev,pMDLg-pRRE,pMD2G和干擾質(zhì)粒組成的包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒載體的包裝。再用包裝好的Tmub1慢病毒載體感染BRL-3A細(xì)胞,培養(yǎng)72小時后,收取細(xì)胞,并提取細(xì)胞蛋白做Western Blot檢測。結(jié)果顯示C0020 Sh2-Hops-256干擾效果最佳。將含有此質(zhì)粒的Tmub1 RNAi慢病毒載體命名為LV256并進(jìn)行大量包裝。用倍比稀釋法稀釋病毒液并感染Hela細(xì)胞96小時后FACS檢測細(xì)胞GFP陽性率,得到滴度為2.3×108TU/ml的病毒,以不同MOI值(20、30、50、70)確定使目的細(xì)胞達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效果時的MOI值,使用MOI=70的慢病毒感染BRL-3A后在倒置熒光顯微鏡下檢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%,且細(xì)胞生長狀態(tài)良好。 3.在上述實驗基礎(chǔ)上使用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BRL-3A/256。該細(xì)胞系中(LV256組)Tmub1 mRNA和蛋白表達(dá)均較Control組和Negative組顯著降低(*p0.05)。Tmub1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系BRL-3A/256建立成功,可用于后續(xù)研究。 4. RT-PCR和Western Blot檢測IL-6對Tmub1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。使用5ng/ml重組IL-6能夠誘導(dǎo)體外BRL-3A細(xì)胞Tmub1表達(dá)水平顯著升高(#p0.05);在BRL-3A/256細(xì)胞系中,Tmub1表達(dá)水平顯著降低(*p0.05),而且IL-6刺激能夠部分逆轉(zhuǎn)Tmub1的RNA干擾效果,使BRL-3A/256細(xì)胞中Tmub1表達(dá)上調(diào)(#*p0.05)。 5.在Tmub1 RNA干擾對IL-6誘導(dǎo)STAT3表達(dá)的影響實驗研究中發(fā)現(xiàn), IL-6可使BRL-3A和BRL-3A/256細(xì)胞中STAT3表達(dá)水平較明顯上調(diào)(#p0.05,#*p0.05);在LV256組,BRL-3A/256細(xì)胞中STAT3表達(dá)也較對照組明顯增強(qiáng)(*p0.05)。以上結(jié)果表明,IL-6和Tmub1 RNAi均可使BRL-3A細(xì)胞STAT3表達(dá)上調(diào),且兩者的共同作用可以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞中STAT3的表達(dá)。同時,Tmub1可能對STAT3的表達(dá)有一定的抑制作用。 6.使用同樣方法我們進(jìn)一步檢測了細(xì)胞中pSTAT3的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示,在Control組、Negative組以及LV256組(均無IL-6刺激),細(xì)胞中pSTAT3的表達(dá)水平很低,而無論是給予IL-6刺激的BRL-3A細(xì)胞還是Tmub1 RNA干擾的BRL-3A/256細(xì)胞中,pSTAT3的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(#p0.05,#*p0.05)。更值得注意的是,在IL-6和Tmub1 RNAi的共同作用下pSTAT3表達(dá)可進(jìn)一步上調(diào)(#*p0.05),而當(dāng)單獨給予IL-6刺激時,pSTAT3的表達(dá)水平卻低于兩者共同作用時的表達(dá)水平(#p0.05),說明IL-6與Tmub1之間可能存在一定的關(guān)聯(lián),Tmub1可能抑制細(xì)胞中IL-6誘導(dǎo)的STAT3的活化。 結(jié)論: 1.通過成功構(gòu)建Tmub1的慢病毒真核表達(dá)載體,并感染大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株,或建立Tmub1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系,可以有效干擾肝細(xì)胞Tmub1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。 2. IL-6可誘導(dǎo)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞中Tmub1表達(dá)上調(diào),也可部分逆轉(zhuǎn)Tmub1 RNA干擾后Tmub1的表達(dá)抑制效應(yīng)。 3. IL-6可誘導(dǎo)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞中STAT3表達(dá)上調(diào),Tmub1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系BRL-3A/256中STAT3的表達(dá)也顯著增強(qiáng),而在兩者的共同作用下,STAT3表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。提示Tmub1可抑制STAT3的表達(dá)。 4.在無IL-6刺激的實驗分組中,RT-PCR和Western Blot均未檢測到磷酸化STAT3(pSTAT3)表達(dá),或表達(dá)很低(LV256組),IL-6可明顯增強(qiáng)BRL-3A和BRL-3A/256細(xì)胞中pSTAT3的表達(dá)。而當(dāng)IL-6與Tmub1 RNAi共同作用時(IL-6+LV256),pSTAT3的表達(dá)又明顯強(qiáng)于單獨IL-6刺激時的表達(dá),這就表明Tmub1可能參與了IL-6誘導(dǎo)的STAT3的活化過程,對STAT3的磷酸化起到一定的抑制作用。 5.由上述結(jié)論我們推斷Tmub1在一定程度上抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3表達(dá)增強(qiáng)以及活化,從而在IL-6誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖過程中起到重要的調(diào)控作用,防止細(xì)胞過度增殖。
【圖文】：

Tmub1 RNAi 慢病毒載體感染第二天，可見病毒已成功感染大鼠肝 BRL-3A 細(xì)胞。圖 1 慢病毒感染第二天熒光圖片慢病毒感染第三天，，可見被感染的肝細(xì)胞較前一天明顯增多。圖 2 慢病毒感染第三天熒光圖片

52慢病毒感染第三天，可見被感染的肝細(xì)胞較前一天明顯增多。圖 2 慢病毒感染第三天熒光圖片G418 殺傷實驗過程中所見病毒感染的陽性細(xì)胞團(tuán)。圖 3 G418 殺傷實驗熒光圖片
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉孟剛;Tmubl在IL-6誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

本文編號：2655803