【摘要】： 目的： 1.觀測在人的肝臟活檢樣本中,病毒的感染與組織中抗炎癥因子的關(guān)系,為進一步研究抗炎癥因子在感染免疫中的作用奠定基礎。 2.研究抗炎癥細胞因子是否影響TLR3誘導的抗病毒活性以及抗病毒介質(zhì)的產(chǎn)生。探討抗炎癥細胞因子對TLR3受體的表達以及信號通路的影響。了解抗炎癥因子對活化的肝臟非實質(zhì)細胞介導的適應性免疫應答的作用及可能的機制。 3.了解土撥鼠IL-10R的序列,蛋白表達胞外段,制備其多克隆抗體并研究其在WHV慢性感染土撥鼠動物中的作用。 方法： 1.收集病人肝臟活檢樣本,抽提肝臟總RNA, real time RT-PCR檢測HCV病毒RNA, IL-10, TGF-β的表達。 2.分離小鼠非實質(zhì)細胞并體外培養(yǎng),poly I:C分別刺激抗炎癥細胞因子預處理和未處理的細胞,real time RT-PCR檢測細胞中IP-10, IFI-T1, ISG15, TNF-α和IFN-β的表達。病毒保護實驗檢測上清的抗病毒作用。 3.抗炎癥因子預處理非實質(zhì)細胞,經(jīng)TLR3配體刺激后,real time PCR和Western blot分別檢測TLR3 RNA水平和蛋白水平的表達。利用NF-κB抗體檢測其轉(zhuǎn)位和磷酸化。IRF3報告基因轉(zhuǎn)染非實質(zhì)細胞,再用抗炎癥因子預處理,poly I:C刺激細胞后檢測IRF3的活化。將抗炎癥因子預處理并刺激后的細胞,與同種異體T細胞混合培養(yǎng),ELISA檢測上清IFN-γ的產(chǎn)生,同時檢測T細胞的增殖。FACS檢測抗炎癥因子對TLR3誘導的共刺激分子(CD80, CD86, CD40, MHCⅡ)表達的影響。 4.從正常土撥鼠脾臟組織中克隆IL-10R的序列,測序并比對分析序列與其他物種在RNA水平和蛋白水平的同源性；原核表達IL-10R的胞外段,純化后免疫家兔獲得多克隆抗體,并用ELISA和免疫熒光檢測抗體的效價。應用抗體體外阻斷IL-10R,檢測抗原特異性的T細胞的增殖。 結(jié)果： 1.在肝臟活檢標本中,HCV的陽性率與TGF-β的表達水平呈現(xiàn)正相關(guān)。 2.用抗炎癥因子預處理非實質(zhì)細胞后,再用poly I:C刺激,非實質(zhì)細胞表達IP-10,IFI-T1, ISG15, TNF-α和IFN-β水平明顯被抑制,并且具有明顯的劑量依賴效應。預處理后的細胞上清的抗病毒活性也較未處理組減弱。 3.與未處理組相比,抗炎癥因子處理組的非實質(zhì)細胞的TLR3的RNA和蛋白表達水平均明顯的降低。抗炎癥因子通過抑制NF-κB和IRF3的轉(zhuǎn)位和磷酸化,進而抑制NF-κB和IRF3的活化,從而干擾TLR3的信號通路,抑制TLR3介導的抗病毒效應和免疫應答。 4.TLR3活化的肝臟非實質(zhì)細胞具有活化同種異體的T細胞的能力,導致T細胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生。而抗炎癥因子的處理則可拮抗這種作用。FACS結(jié)果提示,抗炎癥因子的處理可以降低TLR3誘導的CD80和CD86表達。 5.土撥鼠IL-10R序列全長1728bp,可編碼575個氨基酸,與人和小鼠的IL-10R在核苷酸水平的同源性分別為80.11%和70.60%,在蛋白質(zhì)水平的同源性分別為71.53%和56.42%。 6.土撥鼠IL-10R胞外段包含621個核苷酸,將其插入原核表達載體pET30a后,轉(zhuǎn)入BL21表達菌,經(jīng)IPTG誘導后得到約27kDa的原核蛋白。 7.純化蛋白免疫家兔得到多克隆抗體,抗血清的ELISA效價大約1：50萬,免疫熒光效價為1：200。在慢性感染的土撥鼠中,IL-10R的阻斷可以上調(diào)抗原特異性的T細胞的增殖。 結(jié)論： 1.在肝臟活檢標本中TGF-β的表達與病毒感染相關(guān)。 2.在小鼠肝臟非實質(zhì)細胞中,外源性的IL-10和TGF-β,可以劑量依賴性的抑制TLR3介導的抗病毒效應以及干擾素應答基因的表達。這種抑制效應與抑制TLR3本身的表達以及其信號通路有關(guān)。 3.外源性的IL-10和TGF-β可能通過抑制非實質(zhì)細胞表面的信號分子表達,進而抑制活化的NPC細胞介導的T細胞的活化。 4.首次獲得了土撥鼠IL-10R的全長序列,構(gòu)建了其胞外段的原核表達質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)原核表達獲得的目的蛋白具有較強的抗原性。利用純化的蛋白,制備出了抗-IL-10R多克隆抗體,可以用來檢測IL-10R在組織或細胞中的表達情況。應用抗體體外阻斷IL-10R,有效的上調(diào)抗原特異性的T細胞的增殖。本研究的創(chuàng)新點及意義： 1.了解了肝臟活檢病人肝內(nèi)HCV與抗炎癥因子表達水平的關(guān)系,研究了抗炎癥因子是否可以抑制TLR3介導的抗病毒效應,首次在肝臟非實質(zhì)細胞中探討了TLR3相關(guān)的負調(diào)節(jié)機制。為研究慢性感染的抗病毒狀態(tài)和免疫狀態(tài)提供了參考。 2.了解了抗炎癥因子對TLR3本身及其信號通路的影響,并同時觀察了抗炎癥因子對TLR3介導的T細胞的活化的影響,及其可能的影響途徑,為深入的研究其機理提供了實驗依據(jù)。 3.利用純化IL-10R蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,為下一步研究IL-10R的生物學功能以及研究IL-10/IL-10R系統(tǒng)在HBV慢性感染中的作用提供了重要的實驗工具。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2624814