【摘要】：目的: (1)體外培養(yǎng)JEGⅢ,確定Ad-HGF感染人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(JEGⅢ)的最佳感染強(qiáng)度,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞對(duì)HGF的表達(dá)水平,初步探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)JEGⅢ的調(diào)節(jié)作用,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 (2)Ad-HGF以最佳感染強(qiáng)度轉(zhuǎn)染JEGⅢ,建立乙型肝炎病毒(HBV)感染轉(zhuǎn)染Ad-HGF的JEGⅢ細(xì)胞模型,從形態(tài)學(xué)及定量?jī)煞矫嫣接慔GF對(duì)HBV感染JEGⅢ的作用,為HBV宮內(nèi)感染的防治提供理論依據(jù)。 方法: 第一部分體外培養(yǎng)JEGⅢ,以攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)為實(shí)驗(yàn)組,攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)為對(duì)照組,不同感染強(qiáng)度(MOI)(10,25,50,100,200,400,800,1600)轉(zhuǎn)染絨毛膜癌細(xì)胞系JEGⅢ,通過(guò)MTT法(檢測(cè)細(xì)胞損傷程度)篩選和確定最佳MOI(高轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷),作為下一步攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最優(yōu)條件。以最佳的MOI轉(zhuǎn)染JEGⅢ后0,24,48,72h后,收集細(xì)胞上清,用ELISA法檢測(cè)HGF蛋白的表達(dá)水平。 第二部分基于前期研究,于5% CO2,37℃的培養(yǎng)箱中,用含5%血清濃度的培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓,培養(yǎng)JEGⅢ細(xì)胞至50%鋪滿時(shí),Ad-HGF以最佳MOI(200pfu/cell)轉(zhuǎn)染JEGⅢ,48h后再加入HBV陽(yáng)性血清(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科采自乙型肝炎志愿者,2×108HBV-DNA/L),使其終濃度為100DNA/細(xì)胞,共同孵育24h后,每隔12h,分別于感染HBV后24,36,48,60,72h收集上清及細(xì)胞,將細(xì)胞用PBS洗一遍,800 r/min離心10min,棄去上清,再加入200μlPBS,置于-70℃冰箱中冷凍30分鐘,再放入37℃水浴中,反復(fù)凍融三次,1000 r/min離心10min,吸取上清,與所收集培養(yǎng)上清混勻,分別用HE、GIMSA染色及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)物中HBV-DNA。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: (1)以高轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷為標(biāo)準(zhǔn),確定最佳MOI為200pfu/cell。 (2)Ad-HGF轉(zhuǎn)染JEGⅢ不同時(shí)間段后,ELISA法檢測(cè)HGF表達(dá)水平的結(jié)果顯示:Ad-HGF有效的導(dǎo)入了細(xì)胞,且HGF表達(dá)水平48h內(nèi)有時(shí)間依賴性,72h開(kāi)始下降。 (3)HE染色顯示Ⅱ組較Ⅰ組細(xì)胞有較明顯染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。Ⅲ組較空白對(duì)照組無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。GIMSA染色與HE染色結(jié)果相近。 (4)電鏡顯示:Ⅱ組較Ⅰ組細(xì)胞有較明顯細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴模糊不清或消失,核周間隙增寬,線粒體擴(kuò)張,核膜模糊等現(xiàn)象,且Ⅱ組胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)球形HBsAg顆粒,呈圓球形;Ⅳ組、空白對(duì)照組可見(jiàn)胞膜完整清晰,核仁大而明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的脂滴、線粒體、高爾基器、糖原顆粒以及大量游離的核糖體,兩細(xì)胞膜接近處可見(jiàn)明顯的細(xì)胞連接,為橋粒連接。Ⅲ組較Ⅳ組無(wú)明顯變化。 (5)分別于24h、36h、48h、60h、72h收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)的病毒,在轉(zhuǎn)染Ad-HGF的情況下,各時(shí)間點(diǎn)收集的標(biāo)本中檢測(cè)到的HBV-DNA量均低于未轉(zhuǎn)染Ad-HGF的情況,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示HGF對(duì)HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞有保護(hù)作用,而各時(shí)間點(diǎn)之間HBV-DNA量差異不顯著 結(jié)論: (1) HGF可有效導(dǎo)入JEGⅢ,并促進(jìn)細(xì)胞的增殖。 (2) HGF可有效抑制HBV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞。
【圖文】：

和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。Ⅳ組可見(jiàn)細(xì)胞聚集單層片狀鋪展生長(zhǎng),胞漿呈淺紅色,胞核呈淺紫色,核漿比例明顯，，可觀察到體積較大、有多個(gè)核在的巨細(xì)胞。Ⅲ組較空白對(duì)照組無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。

-32-圖 2： Gimsa 染色 a:Ⅰ轉(zhuǎn)染 HGF 的 JEG3 細(xì)胞和 HBV 共培養(yǎng)組；b：Ⅱ未轉(zhuǎn)染 HGF的JEG3細(xì)胞和HBV共培養(yǎng)組；c：Ⅲ 轉(zhuǎn)染HGF的JEG3細(xì)胞組；d：Ⅳ 空白對(duì)照組(×200)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2621555