發(fā)布時間：2020-04-06 00:07

【摘要】：背景： 肝星狀細胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝纖維化的主要細胞，其激活、轉(zhuǎn)化被認為是肝纖維化發(fā)病的中心事件，為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）產(chǎn)生的重要來源。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species, ROS），調(diào)控HSCs內(nèi)纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在肝纖維化發(fā)病中起關(guān)鍵作用，是抗纖維化的重要靶點。NOX產(chǎn)生的ROS可介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol-3kinase/Akt, PI3K/Akt）信號通路激活，促進HSC增殖、抑制其凋亡，導(dǎo)致肝纖維化形成。我們前期體外實驗發(fā)現(xiàn)熊果酸選擇性誘導(dǎo)活化型HSC凋亡、抑制其增殖；瘦素可通過JAK信號通路直接激活NOX，進而產(chǎn)生大量ROS；而熊果酸干預(yù)能下調(diào)瘦素誘導(dǎo)的活化型HSC的NOX亞基Rac1和p22phoxmRNA表達、抑制NOX活性及ROS的產(chǎn)生，阻斷ERK1/2及NF-κB活化，下調(diào)XIAP、TIMP-1和上調(diào)MMP-1基因表達。本課題在此基礎(chǔ)上繼續(xù)深入探討熊果酸對活化型HSC的NOX其他亞基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白的表達，信號通路PI3K、Akt、P38MAPK活性及其產(chǎn)生的效應(yīng)TIMP-1、MMP-1的影響，以闡明熊果酸誘導(dǎo)活化型HSC凋亡及抗纖維化機制。 目的： 觀察熊果酸對大鼠活化型肝星狀細胞（HSC-T6）NOX亞基、其調(diào)控的PI3K/Akt、P38MAPK信號通路及產(chǎn)生的效應(yīng)TIMP-1、MMP-1蛋白表達的影響，并探討其機制。 方法： 取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，隨機分成六組：空白對照組、瘦素組（100ng/ml）、熊果酸干預(yù)組(熊果酸50μM+瘦素)、DPI干預(yù)組（DPI20μM+瘦素）、SB203580干預(yù)組（SB20358010μM+瘦素）、LY294002干預(yù)組（LY29400210μM+瘦素）。HSC-T6經(jīng)藥物作用12h后，提取總蛋白，采用Western-blotting檢測NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表達；藥物作用30min后，采用Western-blotting檢測信號通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化；藥物作用24h后，采用Western-blotting檢測TIMP-1及MMP-1蛋白表達。 結(jié)果： 1．熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞內(nèi)NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表達的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞12h后，gp91phox、 p22phox、 p67phox、 Rac1蛋白的表達均較空白對照組顯著升高（均P0.01）；給予熊果酸干預(yù)后gp91phox、 p22phox、p67phox、 Rac1蛋白的表達均明顯低于瘦素組（均P0.01）。 NOX抑制劑DPI及PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白的表達均低于瘦素組（均P0.01）。熊果酸干預(yù)組的gp91phox、p67phox蛋白的表達高于DPI及LY294002干預(yù)組（P0.05），p22phox、Rac1蛋白的表達與DPI、LY294002干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸能抑制瘦素誘導(dǎo)的gp91phox、 p22phox、 p67phox、 Rac1蛋白表達。 2．熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞PI3K、Akt及P38MAPK信號通路活化的影響 2.1.熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞PI3K蛋白表達的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞30min后，細胞內(nèi)PI3K蛋白表達較空白對照組顯著升高（P0.01）；給予熊果酸干預(yù)后PI3K蛋白的表達明顯低于瘦素組（P0.01）。DPI及LY294002干預(yù)后PI3K的表達均低于瘦素組（均P0.01）；熊果酸干預(yù)組的PI3K蛋白的表達與DPI、LY294002干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸可以抑制瘦素誘導(dǎo)的PI3K蛋白表達。 2.2.熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞Akt蛋白磷酸化的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞30min后，細胞內(nèi)P-Akt表達較空白對照組顯著升高（P0.01）；給予熊果酸干預(yù)后P-Akt表達明顯低于瘦素組（P0.01）。DPI及LY294002干預(yù)后P-Akt表達均低于瘦素組（均P0.01）；熊果酸干預(yù)組的P-Akt蛋白的表達低于DPI干預(yù)組（P0.05），與LY294002干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸可以抑制瘦素誘導(dǎo)的Akt蛋白磷酸化。 2.3.熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞P38MAPK蛋白磷酸化的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞30min后，細胞內(nèi)p-P38MAPK表達較空白對照組顯著升高（P0.01）；給予熊果酸干預(yù)后p-P38MAPK表達明顯低于瘦素組（P0.01）。DPI、SB203580及LY294002干預(yù)后p-P38MAPK均低于瘦素組（均P0.01）；熊果酸干預(yù)組的p-P38MAPK的表達低于SB203580及LY294002干預(yù)組（P0.05），與DPI干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸可以抑制瘦素誘導(dǎo)的P38MAPK蛋白磷酸化。 3．熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞TIMP-1、MMP-1蛋白表達的影響 3.1.熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞TIMP-1蛋白表達的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞24h后TIMP-1蛋白表達較空白對照組升高（P0.05）；給予熊果酸干預(yù)后TIMP-1蛋白表達明顯低于瘦素組（P0.01）。DPI、SB203580及LY294002干預(yù)后TIMP-1蛋白表達均低于瘦素組（均P0.01）；熊果酸干預(yù)組的TIMP-1的表達低于LY294002干預(yù)組（P0.05），但與DPI及SB203580干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸可以抑制瘦素誘導(dǎo)的TIMP-1蛋白表達。 3.2.熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細胞MMP-1蛋白表達的影響 瘦素刺激HSC-T6細胞24h后MMP-1蛋白表達較空白對照組降低（P0.05）；熊果酸干預(yù)后MMP-1蛋白表達明顯高于瘦素組（P0.01）。分別給予DPI、SB203580及LY294002干預(yù)后MMP-1的表達均高于瘦素組（P0.01或P0.05）；熊果酸干預(yù)組的MMP-1的表達高于SB203580干預(yù)組（P0.05），與DPI及LY294002干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P0.05）。上述結(jié)果表明熊果酸可以阻斷瘦素誘導(dǎo)的MMP-1蛋白表達下調(diào)。 結(jié)論： 1.熊果酸能抑制瘦素誘導(dǎo)的大鼠HSC-T6細胞NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表達及PI3K/Akt、P38MAPK信號通路的活化。 2.熊果酸下調(diào)TIMP-1蛋白及上調(diào)MMP-1蛋白表達的機制可能與熊果酸抑制NOX調(diào)控的PI3K/Akt及P38MAPK信號通路有關(guān)。
【圖文】：

圖 3.1.1 各組 HSC-T6 細胞 gp91phox蛋白的表達情況果酸對瘦素誘導(dǎo)的 p22phox蛋白表達的影響3.1.2、圖 3.1.2、附圖 2 所示：瘦素刺激 HSC-T6 細胞 12h較空白對照組顯著升高（P<0.01）；熊果酸干預(yù)后 p22phox素組（0.63±0.26 比 1.68±0.45，P<0.01），，熊果酸干預(yù)組hox蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。分別給予 DPI、02 干預(yù)后 p22phox蛋白的表達均低于瘦素組（均 P<0.01）；蛋白的表達與 DPI、SB203580、LY294002 干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)5）。上述結(jié)果表明熊果酸能抑制瘦素誘導(dǎo)的 p22phox蛋白表表 3.1.2 各組 HSC-T6 細胞 p22phox蛋白表達情況目的/內(nèi)參灰度比 ( x s,n=4)組別 p22phox空白對照組 1.00±0.00瘦素組 1.68±0.45**

圖 3.1.2 各組 HSC-T6 細胞 p22phox蛋白的表達情況果酸對瘦素誘導(dǎo)的 p67phox蛋白表達的影響.1.3、圖 3.1.3、附圖 3 所示：瘦素刺激 HSC-T6 細胞 12h 后空白對照組顯著升高（P<0.01）；熊果酸干預(yù)后 p67phox蛋白（0.80±0.19 比 2.05±0.32，P<0.01），熊果酸干預(yù)組與空白對照異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。分別給予 DPI、SB203580 及 Lx蛋白的表達均低于瘦素組（均 P<0.01）；熊果酸干預(yù)組 p67phI 及 LY294002 干預(yù)組（0.80±0.19 比 0.49±0.22，0.80± 0.19 比 SB203580 干預(yù)組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P>0.05）。上述瘦素誘導(dǎo)的 p67phox蛋白表達，但作用弱于 DPI 和 LY294002表 3.1.3 各組 HSC-T6 細胞 p67phox蛋白表達情況目的/內(nèi)參灰度比 ( x s,n=4)組別 p67phox空白對照組 1.00±0.00
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

【引證文獻】

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本文編號：2615715