【摘要】： 目前全世界有超過3.5億的人群感染乙型肝炎病毒(HBV),HBV感染已成為全世界共同的健康問題。HBV屬于嗜肝病毒,在復(fù)制周期中含有轉(zhuǎn)錄過程,而逆轉(zhuǎn)酶缺少校對(duì)功能,因此在復(fù)制過程中容易發(fā)生基因突變,形成不同的準(zhǔn)種。當(dāng)病毒基因組的核苷酸差異大于8%時(shí),即形成了不同的基因型。根據(jù)HBV全基因組序列的差異,HBV被分為8種主要基因型(A-H),這8種基因型在全世界呈地域性分布,我國(guó)最常見的是基因型B和C。在臨床上,HBV前C區(qū)(PC)G1896A突變和核心啟動(dòng)子(BCP)區(qū)A1762T／G1764A突變可分別會(huì)減弱和阻斷HBeAg的表達(dá),常見于HBeAg陰性慢性乙型肝炎(CHB)患者,但國(guó)內(nèi)對(duì)HBeAg陽性CHB患者的PC區(qū)G1896A和BCP區(qū)A1762T／G1764A突變情況了解不夠。與B基因型慢性HBV感染者相比,C基因型慢性HBV感染者的BCP區(qū)突變率較高,HBV活動(dòng)性復(fù)制的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換時(shí)間較晚,且更容易發(fā)展至終末期肝病和肝細(xì)胞肝癌(HCC)。但對(duì)直接來源于B和C基因型CHB患者的臨床分離毒株的生物學(xué)特性尚缺乏系統(tǒng)研究。為了進(jìn)一步研究HBeAg陽性CHB患者中B和C基因型的分布、PC/BCP區(qū)的變異情況及其與HBeAg水平的關(guān)系,系統(tǒng)比較B與C基因型CHB患者HBV臨床分離株基因組復(fù)制,病毒分泌和蛋白表達(dá)等生物學(xué)特性方面的差異,我們共開展了三部分的研究工作。 在第一部分工作中,我們分析了207例中國(guó)HBeAg陽性CHB患者的基因型、BCP/PC區(qū)突變與HBeAg滴度的關(guān)系。所有入選的患者都沒有接受過任何抗病毒治療。通過對(duì)HBV S基因直接PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法確定患者的基因型；通過PCR-RFLP的方法確定BCP/PC區(qū)突變情況,并通過測(cè)序的方法予以證實(shí)。207例患者中,51例(24.6%)感染基因型B,其余的感染基因型C。50%的患者存在BCP區(qū)突變,43%的患者存在PC區(qū)突變,6.3%的患者存在BCP/PC區(qū)的聯(lián)合突變。感染基因型B的患者平均年齡低于基因型C,男性患者比例也低于基因型C�；蛐虲患者的HBV DNA滴度與HBeAg滴度的平均值高于基因型B,雖然這些差別沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與基因型B相比,基因型C BCP區(qū)A1762T／G1764A突變率高,而PC區(qū)G1896A突變率低。 在第二部分工作中,我們對(duì)研究HBV全基因組復(fù)制的方法進(jìn)行了探索。目前采用的研究HBV病毒基因組功能的方法是：采用特定的結(jié)合在PC區(qū)DR1,DR2的引物,通過PCR的方法從患者血清標(biāo)本中擴(kuò)增出全長(zhǎng)的HBV基因組,在體外構(gòu)建可復(fù)制的包含1.1-2倍HBV基因組的載體。將此種1.1-2倍重組體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系后,可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1.1倍HBV基因組長(zhǎng)度的前基因組RNA(pgRNA)。但是,體外構(gòu)建這樣的重組體的程序非常復(fù)雜,不適合大量分析HBV臨床分離株的功能。在本實(shí)驗(yàn)中,我們分析了HBV單體在基因組復(fù)制和蛋白表達(dá)方面的功能。用不同的限制性內(nèi)切酶從不同的含HBV單體或雙體的重組體上酶切釋放產(chǎn)生的3.2 kb HBV單體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,在Huh7細(xì)胞中均可完整表達(dá)HBV基因組,這可能是由于線狀HBV單體進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的環(huán)化酶環(huán)化有關(guān)。如果在轉(zhuǎn)染前利用T4 DNA連接酶將HBV單體環(huán)化,將會(huì)使HBV的復(fù)制能力明顯增強(qiáng)。含有HBV單體的重組體轉(zhuǎn)染后不能復(fù)制病毒基因組,但可以有效的表達(dá)病毒相關(guān)蛋白,如可被BspQI (SapI的同工酶)酶切后釋放出HBV單體的重組體可以表達(dá)完整的HBV表面抗原,可被EcoRI酶切后釋放出HBV單體的重組體可以表達(dá)完整的HBeAg和HBcAg。另外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在使用High-Fidelityplus DNA polymerase進(jìn)行全基因組擴(kuò)增時(shí),所獲得的HBV全基因克隆中大約有1／3的克隆存在基因組復(fù)制或蛋白表達(dá)缺陷,為此,我們?cè)谵D(zhuǎn)化時(shí),不再挑取單個(gè)克隆,而是直接將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中,獲得所有克隆,將克隆群轉(zhuǎn)染細(xì)胞,研究整個(gè)克隆群的復(fù)制和蛋白表達(dá),,這樣可以解決由于單個(gè)克隆轉(zhuǎn)染所帶來的代表性差的問題。 在第三部分工作中,我們采用第二部分建立的研究克隆群復(fù)制的方法,同時(shí)對(duì)15例來自美國(guó)和37例來自中國(guó)的CHB患者血清進(jìn)行全基因擴(kuò)增,將獲得的HBV基因組構(gòu)建為SphI雙體(美國(guó)標(biāo)本),或在體外將3.2 kb單體進(jìn)行環(huán)化,獲得整個(gè)克隆群(中國(guó)標(biāo)本),通過Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染,分析HBV的RNA轉(zhuǎn)錄,蛋白表達(dá)／釋放,基因組復(fù)制和病毒分泌等生物學(xué)特性的差異。Southern blot和Northern blot雜交時(shí)采用了B和C基因型混合探針以減少探針因素對(duì)結(jié)果造成的偏差。我們發(fā)現(xiàn),B和C基因型HBV在用Western blot分析蛋白表達(dá)時(shí)存在兩個(gè)不同點(diǎn),首先他們的表面抗原在電泳時(shí)遷移速率不同,基因型B比基因型C的S遷移速率快,但L遷移速率慢；其次對(duì)preS2抗體的反應(yīng)不同,基因型B的L、M蛋白可以與preS2 (Virogen)結(jié)合但基因型C不能。BCP區(qū)未發(fā)生A1762T／G1764A突變的基因型C precore RNA (pc RNA)和pg RNA的轉(zhuǎn)錄水平及相應(yīng)的基因組復(fù)制水平均比基因型B低。BCP區(qū)發(fā)生A1762T／G1764A突變的基因型C轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平均明顯增強(qiáng),在野毒株BCP區(qū)人為的引入A1762T／G1764A雙突變可以明顯增強(qiáng)HBV的復(fù)制水平。有趣的是,大多數(shù)基因型C的病毒釋放能力明顯比基因型B強(qiáng),目前該現(xiàn)象的分子機(jī)制還不是很清楚。野毒株基因型C復(fù)制能力強(qiáng)但病毒分泌能力弱,這也許是HBV基因型C在可以快速感染肝臟細(xì)胞,病毒活動(dòng)性復(fù)制持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),免疫清除期延遲及更容易發(fā)生BCP區(qū)突變的原因。
【圖文】：

圖1.1.PCR一盯LP和PCR直接測(cè)序的方法確定PC區(qū)G1896A的突變。在RFLP方采用限制性內(nèi)切酶Xagl對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，，酶切產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠分離，野毒株不llG一896A突變株的位置已標(biāo)注，marker:Z000bp分子量人小marker;PC區(qū)突變的陽性對(duì)照;Wt:PC區(qū)突變的野毒株(!鐘險(xiǎn))對(duì)照;卜6，從6份標(biāo)本中DNA。對(duì)第一輪PCR產(chǎn)物改接進(jìn)行測(cè)序，圖中卜排的幾個(gè)序列對(duì)應(yīng)的是_L排圖像中的3(r千“)，不116(右)一號(hào)標(biāo)本。

圖1.2.PCR-盯LP和PCR直接測(cè)序的方法確定BCP區(qū)A1762T/G1764A的突變。1一6標(biāo)和圖1.1所示的6份標(biāo)本屬于同一批標(biāo)本。在盯LP方法中，采用限制性內(nèi)切酶Bcll對(duì)止輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，野毒株和A1762T/G1764A突變株的位置已標(biāo)注，marker:20oobp分子量人小marker;Mu:PC區(qū)變的陽性對(duì)照;Wt:PC區(qū)突變的野毒株(陰性)對(duì)照:1一6，從6份標(biāo)本中酶切的DNA對(duì)第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，圖中卜排的三個(gè)序列對(duì)應(yīng)的是上排圖像中的2(左)，(中)，不l，4(右)號(hào)標(biāo)本。1.3.4性別，年齡和BCP/PC區(qū)突變與HBeAg滴度的關(guān)系表1.3對(duì)影響HBeAg滴度的因素進(jìn)行了分析，從中我們可以看出，不同別間HBeAg滴度沒有顯著差異;但不同年齡段HBeAg滴度是有差別的，<35歲的cHB患者的HBeAg滴度一顯著高于全35歲的CHB患者的HBeAg滴度(20士87.5vs.173.7士101.9;六0.05)。進(jìn)一步采用線性回歸分析發(fā)現(xiàn)在沒有BCPPc區(qū)突變的患者中，年齡和HBeAg滴度之間的回歸系數(shù)是一1.651(圖1.4)，
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 Myron J Tong;Lawrence M Blatt;Jia-Horng Kao;Jason Tzuying Cheng;William G Corey;;Precore/basal core promoter mutants and hepatitis B viral DNA levels as predictors for liver deaths and hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2006年41期

本文編號(hào)：2614621