【摘要】： 小腸缺血再灌注(ⅡR，intestinal ischemia-reperfusion)不僅見于腸部疾病，還多與嚴(yán)重創(chuàng)傷、大手術(shù)、失血性休克、燒傷和嚴(yán)重感染等過程的發(fā)生與發(fā)展相伴隨，是臨床常見的病理生理現(xiàn)象。腸缺血可以導(dǎo)致腸道屏障功能受損，而再灌注過程在補(bǔ)充能量和糾正氧供的同時，還能促使大量原存在于腸腔內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素隨血液循環(huán)移位，嚴(yán)重時能通過激發(fā)全身性炎癥反應(yīng)(SIRS，systemicinflammation response syndrome)而損傷遠(yuǎn)隔器官，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS，mutiple organ dysfunction syndrome)形成。 ⅡR時MODS的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)階段尚未完全闡明。除腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位外，多形核中性粒細(xì)胞(PMN，polymorphonuclear neutrophil)聚集、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)形成、細(xì)胞凋亡紊亂、氧自由基引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等觀點(diǎn)也受到人們關(guān)注。如何有效地防治MODS的發(fā)生和發(fā)展一直是臨床工作所關(guān)注的重要課題，但已經(jīng)嘗試性使用的方法都沒有取得突破性進(jìn)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過去被認(rèn)為是毒性氣體分子的一氧化碳(CO)作為一種細(xì)胞信使分子在生物體內(nèi)具有舒張血管和支氣管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡、抗增殖等多種生理學(xué)作用，在神經(jīng)、呼吸、循環(huán)等生理過程和抑制急性肺損傷、臟器缺血再灌注損傷、器官移植排斥反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。CO對ⅡR所致多器官損傷是否具有防治作用且其作用機(jī)制如何，現(xiàn)階段尚無報(bào)道。本研究通過建立大鼠ⅡR模型，在確定外源性應(yīng)用CO安全性的基礎(chǔ)上，觀察ⅡR不同階段應(yīng)用不同濃度CO對組織超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子形成、細(xì)胞凋亡等的影響，并從細(xì)胞和分子水平探討其可能的作用機(jī)制，為臨床防治ⅡR所致MODS的發(fā)生和發(fā)展提供新的參考。本研究分為三個部分：一、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠血中碳氧血紅蛋白的影響；二、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠多器官損傷的防治作用；三、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠多器官損傷防治作用的機(jī)制探討。 實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性Wistar大鼠64只，體重220～260g。 2、實(shí)驗(yàn)試劑和藥品：標(biāo)準(zhǔn)一氧化碳?xì)怏w(壓力：9.0MPa，濃度：250×10~(-6)／100×10~(-6)，空氣平衡)；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；放免法TNF-α與IL-10檢測試劑盒；p38 MAPK抗體；二抗；電泳用聚丙烯酰胺及Tris、甘氨酸等。 3、實(shí)驗(yàn)器材：CIBA-CORNING238型血?dú)夥治鰞x；Detax壓力監(jiān)測儀；日立H-600-4型透射式電子顯微鏡，8800型超薄切片機(jī)，Olympus ML2000型顯微鏡，NIKON 80IFL-FUW-PF型熒光顯微鏡，GC-911-γ-放射免疫計(jì)數(shù)器；Heraus-Biofuge-PrimoR型超速低溫離心機(jī)；島津UV-260型紫外分光光度計(jì)；UP200H型組織超聲勻漿器；BIO-RAD—PAC300型電泳儀(美國)；BIO-RADMiniPROTEANⅡcell型垂直電泳槽(美國)；Tanon小型轉(zhuǎn)印電泳槽(上海天能公司)；GIS-2020型凝膠掃描成像分析系統(tǒng)：大鼠氣管插管(自制)，帶單向活瓣T型管(自制)；小動物手術(shù)器械等。 實(shí)驗(yàn)方法 一、動物模型制作 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。采用腸系膜上動脈(SMA，SuperiorMesenteric Artery)夾閉-開放方式復(fù)制ⅡR模型。大鼠腹腔注射20％烏拉坦(1.0g·kg~(-1))麻醉，開放股靜脈持續(xù)微泵輸注乳酸鈉林格氏液(10ml·kg~(-1)·h~(-1))。行頸動脈置管(用于測定動脈壓及采血)，氣管切開插管后接帶單向活瓣T型管(活瓣能保證吸入氣為所需氣體，呼出氣進(jìn)入大氣)，保留自主呼吸。常規(guī)消毒后取腹正中切口3～4cm，游離SMA，血壓平穩(wěn)10min后用顯微手術(shù)用無損傷動脈夾關(guān)閉SMA起始部，造成腸缺血；縫合切口，60min后經(jīng)原切口入腹腔，去除動脈夾，恢復(fù)小腸血供120min即為ⅡR模型。 二、實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為8組，每組8只。A組：假手術(shù)對照組，不阻斷SMA，其余手術(shù)過程同其他組；B組：小腸缺血再灌注組。經(jīng)T型管吸入空氣。C組分為C1亞組與C2亞組，缺血前10min開始經(jīng)T型管吸入濃度分別為100ppm、250ppm的CO；D組：分為D1亞組與D2亞組，再灌注開始時經(jīng)T型管吸入濃度為100ppm、250ppm的CO；E組：分為E1亞組與E2亞組，再灌注60min時開始經(jīng)T型管吸入濃度為100ppm、250ppm的CO。 三、觀察指標(biāo)和方法 1、連續(xù)監(jiān)測動脈壓(MAP)變化； 2、血?dú)庵导把刑佳跹t蛋白(COHb)值； 3、組織超微結(jié)構(gòu)檢查(電鏡)； 4、組織多形核中性粒細(xì)胞(PMN)計(jì)數(shù)(光鏡)； 5、組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(TUNEL免疫熒光法)； 6、血漿TNF-α濃度(放免法)； 7、血漿IL-10濃度(放免法)； 8、組織中p38 MAPK的蛋白表達(dá)(Western blot法)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、外源性CO對ⅡR大鼠血中COHb的影響 1、與A組比較，ⅡR各組再灌注后MAP均明顯下降(P＜0.05)；與B組比較，應(yīng)用CO各組MAP變化不明顯(P＞0.05)。 2、A組各時點(diǎn)、B組ⅡR前后各時點(diǎn)COHb濃度無明顯差異(P＞0.05)。 3、與B組相應(yīng)時點(diǎn)比較，應(yīng)用CO各組COHb濃度升高(P＜0.05)，且250ppm組升高更顯著(P＜0.01)。與應(yīng)用CO前相比，100ppm組COHb濃度升高(P＜0.05)，最高到6.8±1.2％；250ppm組COHb濃度升高顯著(P＜0.01)，最高達(dá)到13.3±3.1％。 二、外源性CO對ⅡR大鼠多器官損傷的防治作用 (一)組織超微結(jié)構(gòu)的變化： 1、腸：A組見正常小腸結(jié)構(gòu)。B組結(jié)構(gòu)受損極重，小腸上皮大量微絨毛脫落，細(xì)胞之間細(xì)胞連接松弛，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大部分線粒體嵴溶解；胞質(zhì)有局部溶解，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)邊集，核胞間隙增寬。外源性應(yīng)用CO各組：C1、C2兩組受損較輕，雖胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜模糊不近于正常，但小腸上皮表面微絨毛部分整齊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅輕度擴(kuò)張；E1、E2兩組受損相對較重。C、D、E組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 2、肺：A組結(jié)構(gòu)基本正常。B組結(jié)構(gòu)明顯受損，氣血屏障模糊增厚，Ⅱ型上皮細(xì)胞表面微絨毛短小稀疏，核型不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)多個線粒體空泡變性，板層小體排空式消失；Ⅰ型上皮細(xì)胞部分破損溶解，血管內(nèi)皮細(xì)胞大面積溶解，腔內(nèi)見紅細(xì)胞。外源性應(yīng)用CO各組：C1、C2兩組受損較輕，Ⅱ型細(xì)胞表面微絨毛較完整，部分線粒體完好，多個板層小體存在；而E1、E2兩組受損相對較重。C、D、E組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 3、肝：A組結(jié)構(gòu)基本正常。B組結(jié)構(gòu)略受損，細(xì)胞核膜模糊，異染色質(zhì)邊集，，胞質(zhì)部分溶解，部分線粒體外膜破損。外源性應(yīng)用CO各組肝組織結(jié)構(gòu)均受損較輕，細(xì)胞核核型較不規(guī)則，少量線粒體外膜有破損。C、D、E各組間及組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 4、腎：A組結(jié)構(gòu)正常。B組結(jié)構(gòu)受損輕微，僅見腎小管上皮細(xì)胞核核形不規(guī)則及存在大小不等的溶酶體和大的吞飲泡增多。腎小球足突少部分融合。外源性應(yīng)用CO各組腎組織結(jié)構(gòu)均接近正常，腎小管上皮微絨毛較完整、核形規(guī)則；腎小球基膜連續(xù)，薄厚較均勻，足突有局部的融合。 (二)組織中凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)：(個／高倍視野) 1、腸：B組可見大量凋亡細(xì)胞(52±6)。C、D、E各組明顯少于B組(P＜0.01)，但多于A組(5±2)(P＜0.05)；且C組＜D組＜E組，組間有差異(P＜0.05)；各組內(nèi)亞組數(shù)目有差異，1組均多于2組(P＜0.05)。 2、肺：B組可見大量凋亡細(xì)胞(32±2)。C、D、E各組明顯少于B組(P＜0.01)，但多于A組(2±1) (P＜0.05)；且C組＜D組＜E組，組間有差異(P＜0.05)；各組內(nèi)亞組數(shù)目有差異，1組均多于2組(P＜0.05)。 3、各組肝、腎組織中均僅見少量凋亡細(xì)胞，無明顯差異。 三、外源性CO對ⅡR大鼠多器官損傷防治作用作用機(jī)制探討 (一)組織中PMN計(jì)數(shù)：(個／高倍視野) 1、腸：B組可見大量PMN聚集(66±6)。C、D、E各組明顯少于B組(P＜0.01)，但多于A組(26±2) (P＜0.05)：且C組＜D組＜E組，組間有差異(P＜0.05)；各組內(nèi)亞組PMN有差異，且1組多于2組(P＜0.05)。 2、肺：B組可見較多PMN聚集(52±5)。C、D、E各組明顯少于B組(P＜0.01)，但多于A組(18±2) (P＜0.05)；且C組＜D組＜E組，組間有差異(P＜0.05)；各組內(nèi)亞組雖1組多于2組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 3、肝：B組可見PMN聚集(35±3)。C、D、E各組少于B組(P＜0.01)，但多于A組(13±1) (P＜0.05)；且C組＜D組＜E組，組間有差異(P＜0.05)；各組內(nèi)亞組PMN有差異，且1組多于2組(P＜0.05)。 4、腎：B、C、D、E各組PMN數(shù)目均與A組無明顯差異(P＞0.05)。 (二)血漿TNF-α濃度的變化：(ng／ml) 1、與對照組A組(1.15±0.04)比較，單純ⅡR的B組TNF-α(3.15±0.05)明顯升高(P＜0.05)。 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組TNF-α濃度均明顯低于單純ⅡR的B組(P＜0.05)，且C組＜D組＜E組(P＜0.05)。 3、C、D、E各組內(nèi)亞組比較，2組均低于1組(P＜0.05)。 (三)血漿IL-10濃度的變化：(ng／ml) 1、與對照組A組(15.36±2.37)比較，單純ⅡR的B組IL-10(23.55±4.94)升高(P＜0.05)。 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組IL-10濃度均明顯高于單純ⅡR的B組(P＜0.05)，且C組＞D組＞E組(P＜0.05)。 3、C、D、E各組內(nèi)亞組比較，2組均高于1組(P＜0.05)。 (四)各組織中p38 MAPK蛋白的表達(dá)： 1、與對照組A組比較，單純ⅡR的B組p38 MAPK蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)； 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組p38 MAPK蛋白表達(dá)均明顯高于單純ⅡR的B組(P＜0.05)，且C組＞D組＞E組(P＜0.05)。 3、C、D、E各組內(nèi)亞組比較，2組均高于1組(P＜0.05)。 結(jié)論 1、大鼠在ⅡR過程中吸入濃度為100ppm／250ppm的CO是安全的。 2、外源性CO對大鼠ⅡR所致多器官損傷具有防治作用，且濃度為250ppm的CO比100ppm的CO作用更明顯；缺血前應(yīng)用比缺血及再灌注后應(yīng)用作用更明顯。 3、外源性CO對ⅡR所致多器官損傷的防治作用可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、抑制PMN聚集、抑制TNF-α產(chǎn)生和促進(jìn)IL-10釋放實(shí)現(xiàn)的。 4、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK表達(dá)是外源性CO防治ⅡR所致多器官損傷作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。
【圖文】：

238士 1672士 0.156.3士 2.646.2士 5.3132士10237士 157.2士 0.054.6士 3.043.7士 5.4131士19二、各組動物MAP的變化:見表2，圖1。(一)11、nl、W組:同I組相應(yīng)時點(diǎn)比較，再灌注后的T3、幾時點(diǎn)MAP下降顯著(尸 <0.05);(二)nl、IV組:同n組相應(yīng)時點(diǎn)比較，CO吸入后的幾、幾、幾時點(diǎn)MAP變化無明顯差異(P>0.05)。表2，各組動物MAP變化情況(~Hg，n二8，x士:)幾幾 115士1595士1290士783士8120士991士1072士965士8中 118士792士771士6，78士6*68士5121士8102士1372士4

本文編號：2593990