【摘要】：【背景】 肝再生醫(yī)學一直處在再生醫(yī)學的最前沿，原位肝移植和肝細胞移植均屬于肝再生醫(yī)學的范疇，原位肝移植被認為是目前治療終末期肝病最行之有效的方法。但是由于供肝源缺乏、費用昂貴、免疫排斥等問題使原位肝移植不能成為最主要的治療方式。肝細胞移植可以有效改善終末期肝病患者的肝功,但肝細胞移植目前存在的問題主要有以下兩點：1.依靠供體器官獲得肝細胞，來源缺乏。2.凍存后的肝細胞會丟失部分肝細胞的功能，所以肝細胞在獲得后必須立即使用,這也限制了其在臨床的應用。因此,不依賴于器官捐獻獲得有功能的肝細胞樣細胞，就成了肝再生醫(yī)學亟待解決的問題，獲得有功能的iHEP有望解決供肝和肝細胞來源不足的問題，這對于肝再生醫(yī)學的發(fā)展而言至關重要。目前，iHEP是通過誘導胚胎干細胞(EMC)、誘導性多能干細胞(iPS)、間充質干細胞(MSC)和成纖維細胞而獲得。EMC誘導的iHEP細胞移植到動物體內后有較高的致腫瘤性、致畸胎瘤性且由于受到倫理學的限制，因此目前僅用于藥理學和基礎醫(yī)學研究。iPS是由各種終末細胞去分化而獲得的EMC樣細胞，具有和干細胞類似的分化潛能，在理論上，由iPS獲得的iHEP細胞來源于患者自身，所以不存在免疫排斥和倫理學的問題，但由于iPS的獲得需要轉錄因子的轉染，效率低下且改變了宿主基因，由iPS再分化為iHEP細胞，效率更低，且同樣存在致腫瘤性、致畸胎瘤性的風險。由成纖維細胞直接轉化為iHEP細胞是近年來新的發(fā)現，由成纖維細胞轉分化為iHEP細胞的效率較低，且iHEP不具備成熟肝細胞的某些重要功能。MSC可作為種子細胞的優(yōu)勢在于：其來源廣泛、非侵入性獲得、不存在倫理學問題，移植入動物體內后具有低免疫原性、低致瘤性、低致畸胎瘤性。并且臍帶MSC已經成為再生醫(yī)學理想的細胞來源。由于目前的MSC來源的iHEP細胞還不夠成熟，且分化效率欠佳。為了獲得MSC來源的有功能的iHEP細胞,探索其分化機制就成了肝再生醫(yī)學亟待解決的問題。 MicroRNA是近年來發(fā)現的一類內源性非編碼小RNA，通過抑制該配對區(qū)域mRNA的翻譯或促進其降解從而在轉錄后水平負性調控靶基因的表達。多項研究顯示microRNA參與體內多種生理過程的調控：廣泛參與體內細胞的增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡等多種生理活動。且近來多項研究顯示microRNA參與各種細胞表型的轉化。 【目的】 本課題小組前期工作基礎：⑴成功建立了MSC向肝細胞分化的體外模型；⑵根據microRNA基因芯片和PCR的一致性比對篩選出6個在MSC向肝細胞分化過程中線性升高的一組microRNA（miR-30a、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)；⑶單獨使用該組microRNA和肝特異性miR-122誘導間充質肝細胞，成功地將MSC誘導為有功能的誘導性肝細胞樣細胞(iHEP)。因此本實驗的目的是：在上述工作的基礎上進一步篩減誘導MSC向肝細胞樣細胞分化的關鍵microRNA。 【方法】 1.使用酶消化法分離臍帶MSC：在無菌條件下采集健康孕婦所產足月兒的臍帶，膠原酶消化法獲得純化的MSC，從大體形態(tài)、表面抗原鑒定、骨向分化能力等方面證實該方法分離的細胞是否為MSC，并檢測其純度和分化能力。 2.使用（n-1）的篩減策略：在7mix可誘導MSC為有功能的iHEP細胞的基礎上，依次使用篩減不同microRNA的6mix組合誘導MSC；若6mix組合可誘導MSC為有功能的iHEP細胞，則依照上述策略依次使用篩減不同microRNA的5mix組合誘導MSC，直到篩減到可將MSC誘導為iHP細胞的最少microRNA組合。 3. iHEP細胞的驗證：倒置顯微鏡下觀察大體形態(tài)的變化；使用q-PCR對肝基因在mRNA水平變化進行檢測；western-blot對肝細胞特異蛋白進行檢測；肝細胞特異性功能檢測：PAS糖原染色、LDL攝取實驗、尿素氮合成能力、ICG心臟綠的攝取實驗的檢測用來驗證microRN誘導的iHEP細胞是否具有成熟肝細胞樣的功能。 【結果】 1.本課題小組使用酶消化法分離的MSC在鏡下顯示典型的扁梭狀，4代以后呈現典型的渦旋狀生長方式。流式細胞儀分析表面抗原鑒定結果顯示：本實驗小組分離的臍帶來源的第四代(p4)MSC99.5%可表達MSC的標志分子CD105。同時內皮標志分子CD31以及造血干細胞CD34的檢測結果分別為：1.0%、1.0%，這一結果說明本實驗小組分離的MSC并沒有參雜內皮細胞和血細胞，即證實了本課題小組分離的MSC純度較高。同時利用MSC向骨細胞分化誘導液，來驗證分離所得MSC的分化潛能。結果顯示：向p4的MSC內加入骨細胞向誘導分化培養(yǎng)液16天后，分化的細胞經Alizarin紅染色后顯示（+），即具有骨細胞特有的鈣鹽沉積的作用。鈣鹽沉積的作用是骨細胞所特有的功能，證實了分離出的MSC具有分化潛能。 2.6mix組合誘導結果顯示：各組合的mimics轉染效率均較高，6mix-without-miR-30a(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)組合轉染MSC后的iHEP細胞的特征：細胞具有肝細胞特有的上皮樣細胞形態(tài)，q-PCR檢測肝細胞的特異性基因表達增高，較7mix（miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a、miR-30a）誘導的iHEP細胞，肝細胞特有的ALB的表達略有降低，肝細胞特異性功能檢測：PAS染色、尿素氮合成檢測、ICG攝取實驗、LDL攝取實驗結果均為陽性。6mix-without-miR-1290誘導組的肝基因表達亦較高但低于6mix-without-miR-30a誘導組。而其他6mix誘導組的肝基因表達變化與陰性對照相比無統(tǒng)計學差異。 3.5mix組合誘導結果顯示：各組合的mimics的轉染效率均較高，5mix-without-miR-1290（miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a）組合轉染MSC后細胞具有肝細胞的上皮樣形態(tài)，肝細胞的特異性基因表達增高，較6mix（miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a）誘導組和7mix誘導組，早期肝基因變化無明顯差異，，而中晚期肝基因TF、CYP3A4、G6P表達降低。肝細胞特異性功能檢測：PAS染色結果、尿素氮檢測、ICG攝取實驗結果、LDL攝取實驗結果均為陽性。而其他5mix誘導組的肝基因表達變化與陰性對照相比無統(tǒng)計差異。 4.4mix組合誘導結果顯示：4mix-without-miR-542-5p中AFP的升高具有統(tǒng)計學意義；其他4mix組合肝基因ALB、HNF4A變化較陰性對照無明顯差異。 【結論】 使用酶消化法獲得的臍帶來源的MSC，具有MSC典型的成纖維細胞樣形態(tài)，表達MSC的標志分子，且可分化為骨細胞樣細胞。miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a轉染MSC后細胞可誘導為有功能的iHEP細胞：具有肝細胞的上皮樣形態(tài)，肝細胞的特異性基因表達增高，肝細胞特性功能檢測：PAS染色結果、尿素氮檢測、ICG攝取實驗結果、LDL攝取實驗結果均為陽性。miR-1290和miR-30a是間充質干細胞向肝細胞分化過程的非必需microRNA。首次證實miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a可將MSC分化為有功能的iHEP細胞。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

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