【摘要】：背景非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病進展中的重要階段,隨著疾病的發(fā)展可以進展為肝硬化和肝癌。流行病學調(diào)查顯示,在肥胖人群中NAFLD的患病率顯著提高,肥胖狀態(tài)可導致糖類和脂肪代謝失衡,造成胰島素抵抗,從而產(chǎn)生脂肪肝。因此,肥胖病和NAFLD的關(guān)系越來越受到關(guān)注,對于NAFLD的預防和治療已成為世界性的問題。在NASH的疾病進展過程中,TLRs/IL-1R樣信號通路發(fā)揮了重要作用,Pellino1是一種新發(fā)現(xiàn)的具有E3泛素連接酶活性的蛋白,在TLRs/IL-1R介導的炎癥信號通路中起著關(guān)鍵調(diào)控作用,這與Pellino1通過使TLRs/IL-1R信號通路中關(guān)鍵蛋白(如TRAF6、RIP1)泛素化,調(diào)節(jié)NK-κB的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。Pellino1在NASH的發(fā)展進程中是否發(fā)揮調(diào)控作用?其發(fā)揮作用的機制是否與其對炎癥的調(diào)控作用相關(guān),尚不清楚。肝細胞核因子4(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)是核蛋白受體超家族中的一員,在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。HNF4α在肝臟中高表達,并在肝臟糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),長鏈脂肪酸和乙酰輔酶A可以作為其配體激活其與DNA啟動子的結(jié)合活性。而在NASH發(fā)展進程中,機體內(nèi)FFA水平上升,可能作為轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的配體激活其活性。我們通過對Pellino1啟動子生物信息學分析發(fā)現(xiàn),在Pellino1的啟動子上存在著HNF4α的潛在結(jié)合位點。據(jù)此我們提出假說:在NASH發(fā)展進程中,FFA可以通過激活HNF4α進而調(diào)控Pellino1的基因表達,從而調(diào)控NASH的炎癥反應過程。目的1.探討Pellino1在MCD飲食誘導的NASH發(fā)生發(fā)展中的的作用及其機制2.闡明在FFA誘導的肝細胞中,HNF4α在轉(zhuǎn)錄水平對Pellino1的調(diào)控作用方法1.動物模型為了闡明Pellino1在NASH中的作用以及其可能的機制,動物實驗采用蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline-deficient,MCD)飲食喂養(yǎng)8周構(gòu)建NASH小鼠模型。采用Adv-cre 4x109經(jīng)尾靜脈注射Pellino1 Fln/Fln小鼠,敲除肝臟組織Pellino1表達。C57/BL6小鼠給予MCD飲食和對照Control飲食8周;Fln/Fln小鼠尾靜脈注射Cre腺病毒和等劑量GFP病毒后1周后開始MCD 8周,觀察小鼠肝臟大體形態(tài)變化;檢測小鼠體重、肝臟體重、肝臟體重比;HE染色觀察肝臟炎性細胞、脂肪浸潤;甘油三酯酶法檢測血液及組織中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量;檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase AST)水平;F4/80和CD45免疫組化方法檢測巨噬細胞和淋巴細胞浸潤水平。Western blot方法檢測Pellino1、HNF4α蛋白水平,RT-PCR方法檢測炎癥因子水平。2.細胞模型體外細胞實驗采用游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)刺激肝原代細胞,通過Western blot方法檢測Pellino1、HNF4α蛋白水平,通過RT-PCR方法檢測炎癥因子IL-1β、TNFα、MCP-1的m RNA水平,通過報告基因?qū)嶒灪虲HIP實驗檢測轉(zhuǎn)錄因子HNF4α與Pellino1啟動子結(jié)合水平。結(jié)果一、Pellino1敲除改善MCD飲食誘導的NASH肝組織中的炎癥反應1.與對照飲食組小鼠相比,MCD組小鼠肝臟脂肪沉積明顯增加,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,炎癥細胞浸潤明顯,血漿ALT水平上升,Pellino1蛋白、m RNA水平上升。2.Cre病毒Pellino1敲除組小鼠與空載病毒轉(zhuǎn)染組相比脂肪積聚、炎癥細胞浸潤減少,炎癥因子IL-1β、TNFαm RNA水平下降,p-IκBα表達減少。3.FFA處理組肝細胞與BSA對照組相比,炎癥因子水平上升;Peli1敲除組與空載病毒組相比,炎癥因子水平有一定程度下降。二、在NASH模型中,HNF4α在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Pellino11.在報告基因?qū)嶒炛?HNF4α轉(zhuǎn)錄組與對照質(zhì)粒組相比,Pellino1啟動子活性明顯上升。突變Pellino1啟動子組與完整啟動子組相比,啟動子活性明顯下降。2.在CHIP實驗中,HNF4α組與對照Ig G組相比,Peli1結(jié)合活性明顯上升,FFA刺激后,結(jié)合活性上升。結(jié)論實驗結(jié)果顯示Pellino1在MCD飲食誘導的NASH發(fā)展進程中發(fā)揮了重要的作用,而脂肪代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HNF4α可以增強Pellino1啟動子活性從而促進Pellino1蛋白表達,并促進FFA誘導的體外培養(yǎng)肝細胞炎癥因子的分泌。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.1

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本文編號：2558133