【摘要】：背景： 肝纖維化是由多種病因所致的一種慢性肝損傷，在其發(fā)展過程中持續(xù)存在創(chuàng)傷愈合反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）作為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的主要來源，它的激活、增殖和轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵。近年研究表明，HSCs內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由NADPH氧化酶（NADPHoxidase, NOX）產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）所調(diào)控，因此通過抑制HSCs內(nèi)NOX的活性，阻斷促纖維化因子在HSCs內(nèi)信號通路的傳遞，有望成為抑制肝纖維化的新方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸（ursolic acid，UA）可抑制瘦素誘導(dǎo)活化型HSCs的NOX的表達(dá)及其調(diào)控的信號通路活化。血小板衍生生長因子（Platelet-derived growth factors，PDGFs）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等多種促纖維化因子均參與HSCs的激活與增殖，熊果酸是否能阻斷瘦素以外的促纖維化因子引起的HSC內(nèi)信號通路激活，尚待進(jìn)一步研究。因此，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討熊果酸對PDGF誘導(dǎo)的HSCs內(nèi)NOX激活及纖維化信號通路的影響，力求闡明熊果酸抗纖維化的作用靶點(diǎn)和機(jī)制。 目的： 觀察熊果酸對PDGF誘導(dǎo)的大鼠活化型肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）NOX激活及下游信號通路活化的影響。 方法： 取對數(shù)生長期HSC-T6細(xì)胞，隨機(jī)分成以下各組：空白對照組、Rosup陽性對照組（5μg/ml）、熊果酸組（50μM）、PDGF-BB組（10ng/ml）、熊果酸干預(yù)組(熊果酸50μM+PDGF-BB10ng/ml)、DPI干預(yù)組（DPI20μM+PDGF-BB10ng/ml）、SB203580干預(yù)組（SB20358010μM+PDGF-BB10ng/ml）、LY294002干預(yù)組（LY29400210μM+PDGF-BB10ng/ml）。為觀察熊果酸對I型膠原表達(dá)的影響，藥物分別處理HSC-T612h、24h后，采用熒光定量PCR檢測I型膠原mRNA的表達(dá)；為觀察熊果酸對NOX亞基p47phox蛋白膜移位的影響，藥物分別處理15min、30min、60min后，采用Western-blotting檢測膜蛋白p47phox的表達(dá)；為觀察熊果酸對HSCs內(nèi)ROS水平的影響，藥物分別處理10min、30min、1h、2h后，采用活性氧檢測試劑盒，利用活細(xì)胞工作站及熒光酶標(biāo)儀檢測DCF熒光強(qiáng)度，觀察ROS水平；為觀察熊果酸對NOX調(diào)控的信號通路PI3K-Akt、P38MAPK的影響，藥物分別處理15min、30min、60min后，采用Western-blotting檢測PI3K、P-AKT、P-P38MAPK蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1．熊果酸對PDGF誘導(dǎo)HSC-T6內(nèi)I型膠原mRNA表達(dá)的影響 HSC-T6經(jīng)藥物刺激12h后，PDGF組I型膠原mRNA的表達(dá)比空白對照組明顯增加（P0.01）；熊果酸干預(yù)組I型膠原表達(dá)較PDGF組明顯下降（P0.01），較空白對照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；熊果酸組I型膠原的表達(dá)低于空白對照組（P0.05）；DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組及LY294002干預(yù)組I型膠原的表達(dá)都明顯低于PDGF組（P0.01）；熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和LY294002干預(yù)組之間I型膠原表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的I型膠原mRNA的表達(dá)。 2．熊果酸對PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞p47phox亞基向膜移位的影響 HSC-T6經(jīng)藥物作用15min后，PDGF組膜蛋白p47phox表達(dá)比空白對照組顯著增加（P0.05）；熊果酸干預(yù)組p47phox的表達(dá)較PDGF組明顯降低（P0.05），，而與空白對照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；熊果酸組p47phox的表達(dá)明顯低于空白對照組（P0.01）；DPI、SB203580及LY294002干預(yù)組p47phox的表達(dá)均低于PDGF組（P0.05）。熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和LY294002干預(yù)組之間膜蛋白p47phox的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導(dǎo)的NOX亞基p47phox蛋白的向膜移位。 3.熊果酸對PDGF介導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)ROS生成的影響 HSC-T6經(jīng)藥物作用1h后，PDGF組DCF熒光強(qiáng)度比空白對照組明顯升高（P0.01），與Rorup陽性對照組無顯著差異（P0.05）；熊果酸干預(yù)組和DPI干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度均顯著低于PDGF組和Rosup陽性對照組（P0.01），與空白對照組無顯著差異（P0.05）；熊果酸組的DCF熒光強(qiáng)度顯著低于空白對照組（P0.01）；熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組之間DCF熒光強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)ROS的產(chǎn)生。 4．熊果酸對PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)PI3K-Akt、P38MAPK信號通路的影響 4.1.熊果酸對PDGF介導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)PI3K表達(dá)的影響 HSC-T6經(jīng)藥物作用30min后，PDGF組PI3K蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組（P0.01）；熊果酸干預(yù)后PI3K蛋白的表達(dá)低于PDGF組和空白對照組（P0.01，P0.05）；熊果酸組PI3K的表達(dá)低于空白對照組（P0.01）；DPI及LY294002干預(yù)后PI3K的表達(dá)均低于PDGF組（P0.01）；熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、LY294002干預(yù)組之間PI3K表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導(dǎo)的PI3K蛋白的表達(dá)。 4.2.熊果酸對PDGF介導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)p-Akt表達(dá)的影響 HSC-T6經(jīng)藥物作用30min后，PDGF組p-Akt蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組（P0.01）；熊果酸干預(yù)組p-Akt蛋白的表達(dá)較PDGF組顯著下降（P0.01），較空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。熊果酸組P-Akt的表達(dá)明顯低于空白對照組（P0.01）；DPI干預(yù)組及LY294002干預(yù)組P-Akt表達(dá)均低于PDGF組（P0.05）；熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、LY294002干預(yù)組之間p-Akt表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導(dǎo)的p-Akt蛋白的表達(dá)。 4.3.熊果酸對PDGF介導(dǎo)的HSC-T6內(nèi)P-P38MAPK表達(dá)的影響 HSC-T6經(jīng)藥物作用30min后，PDGF組P-P38MAPK蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組（P0.01）；熊果酸干預(yù)后P-P38MAPK蛋白的表達(dá)較PDGF組顯著下降（P0.01），較空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。熊果酸組P-P38MAPK的表達(dá)明顯低于空白對照組（P0.01）；SB203580及DPI干預(yù)組P-P38MAPK表達(dá)均低于PDGF組（P0.01）；熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組之間P-P38MAPK表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導(dǎo)的P-P38MAPK蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： 1、PDGF能誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的NOX亞基p47phox蛋白膜移位使NOX活化，并引起P38MAPK、PI3K-Akt信號通路的激活及I型膠原mRNA的表達(dá)增加。 2、熊果酸可抑制PDGF誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞I型膠原mRNA的表達(dá)，其機(jī)制可能與通過抑制NOX亞基p47phox蛋白膜移位，阻止NOX活化產(chǎn)生ROS，從而阻斷P38MAPK、PI3K-Akt信號通路的激活有關(guān)。
【圖文】：

圖 3.1 HSC-T6 的 I 型膠原 mRNA 的表達(dá)情況PDGF誘導(dǎo)HSC-T6 細(xì)胞p47phox圖3.2、附圖2所示：HSC-T6經(jīng)藥物作用15min后，蛋白向膜上白對照組顯著增加（P<0.05）；熊果酸干預(yù)組

圖 3.2 HSC-T6 膜蛋白p47phox PDGF 誘導(dǎo)的 HSC-T6 內(nèi) ROS 生成的影的表達(dá)情況圖3.3、附圖3所示：HSC-T6經(jīng)藥物作用1h后，PDG組明顯升高（P<0.01），與Rorup陽性對照組無顯著
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2532635